[发明专利]用于产生稳定转染细胞的方法和组合物

说明书

本发明提供了涉及高产细胞系的方法和组合物。一些实施方案涉及用于筛选这类细胞系以及用于产生这类细胞系的有效方法。这些细胞系可以用来生产大量的蛋白质。为了快速地产生用于临床前研究和临床试验两者的大量重组蛋白或疫苗，几乎所有药物开发都将面临同样的挑战性障碍，即迅速地产生高稳定性的生产者。开发和鉴定稳定细胞系是生物制药发展的关键部分。

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/794,785,3的优先权权益，通过引用将其整体并入本文。

发明背景

1.技术领域

本发明一般地涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及用于产生稳定转染细胞的新的方法和组合物。

2.相关技术说明

为了快速地产生用于临床前研究和临床试验两者的大量重组蛋白质或疫苗，几乎所有药物开发都将面临同样的挑战性障碍，即迅速地产生高稳定性的生产者。开发和鉴定稳定细胞系是生物制药开发的关键部分。然而，稳定细胞系的开发是一个复杂的过程，通常包括转染、选择、克隆/筛选、比较研究、表征和稳定性研究。转染是该过程的第一步，其将决定在所要求的时间线内是否可以产生具有高效价和良好产品质量的稳定细胞系。许多现有的转染方法已表现出低的转染效率(如PEI和脂质方法)或具有中度转染效率的低细胞生存力(其他EP方法)(Tait 2004年；Derouazi 2004；Reisinger 2009；Florea 2002)。这两个限制因素导致需要冗长的、复杂的、耗时的和资源密集型的选择过程。通常，将筛选几千个克隆以鉴定良好的稳定克隆(Dharshanan 2011；Shi 2011)并且该领域中的许多制药公司投资并使用了用于液体处理和克隆挑选/选择两者的扩增自动化系统，例如AmbrTM系统、ClonePiX、FACS分选和SimCell系统(Dharshanan 2011；Shi 2011；Moses 2012；Lindgren2009；Sleiman 2008，Carroll 2004；Thomas 2008)。其他人也已经开发了特定的专有表达构建体和细胞系以产生高产率的稳定细胞系(de la Cruz 2006；Fan 2012；Nair 2011)。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及产生外源蛋白质或基因产物的稳定细胞系，包括高产细胞系。可以产生并且使用非常高浓度的抗生素(即，通常将杀伤细胞(即使其被转染了赋予抗生素抗性的基因)的浓度水平)鉴定这样的细胞系。一些实施方案涉及使用包括“条件致死浓度”的选择剂的培养条件，“条件致死浓度”指的是在该浓度下孵育至少6天后，当对未转染的细胞相对于转染的细胞的生存力百分比进行比较时，将杀伤至少10％以上细胞的选择剂(例如，抗体)的浓度水平。

因此，在一些实施方案中，有用于产生表达外源多肽、多肽的复杂组装(例如，病毒样颗粒，VLP)或核苷酸和其他分子的复杂组装(例如，基因治疗病毒载体，例如慢病毒、腺病毒或腺相关病毒)之稳定细胞系的方法，所述方法包括使用电穿孔将表达构建体转染进细胞中，其中所述表达构建体包含：i)可选择基因和ii)编码一个或更多个外源多肽本身或者连同其他分子的序列；以及在包含条件致死浓度的选择剂的培养条件下根据可选择基因的表达进行选择。在本文所描述的方法中使用电穿孔将核酸递送进细胞中。步骤包括用所期望的核酸对细胞进行电穿孔以使得一个或更多个核酸分子进入细胞中。