[发明专利]类毒素、组合物和相关的方法

权利要求书

1.一种用于生产经纯化的艰难梭菌(C.difficile)毒素的方法，所述方法包括：

a)将包含艰难梭菌毒素的不纯的含水溶液施用于疏水相互作用载体，以将艰难梭菌毒素结合至所述载体；

b)从所述疏水相互作用载体洗脱结合的艰难梭菌毒素；

c)将来自步骤(b)的经洗脱的艰难梭菌毒素施用于选自以下的阴离子-交换载体：(i)具有季胺官能团的聚甲基丙烯酸酯树脂；和(ii)具有季胺官能团的聚醚砜膜，以将艰难梭菌毒素结合至所述载体；和，

d)从所述阴离子-交换载体洗脱结合的艰难梭菌毒素。

2.权利要求1的方法，所述方法还包括在步骤(a)之前，使包含艰难梭菌毒素的不纯的含水溶液经历切向流过滤。

3.权利要求1或2的方法，所述方法还包括在步骤(d)之后回收经纯化的艰难梭菌毒素。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述毒素为艰难梭菌毒素A。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述毒素为艰难梭菌毒素B。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述疏水相互作用载体为具有连接的丁基S基团的基质或具有连接的丙基的基质。

8.权利要求6的方法，其中所述疏水相互作用载体为具有连接的丙基的基质，并且在硫酸铵存在下，将不纯的含水溶液施用于疏水相互作用载体。

9.权利要求8的方法，其中在约0.8-约1.0M硫酸铵存在下，将所述不纯的含水溶液施用于疏水相互作用载体。

10.权利要求1-5、8或9中任一项的方法，其中步骤(b)在不存在有机溶剂下实施。

11.权利要求6的方法，其中所述疏水相互作用载体为具有连接的丁基S基团的琼脂糖凝胶树脂。

12.权利要求6或11的方法，其中在步骤(a)和(b)之后，在不纯的含水溶液中回收约70％的毒素A和/或约90％的毒素B。

13.权利要求6、11或12中任一项的方法，其中步骤(b)在不存在有机溶剂下实施。

14.权利要求1的方法，其中所述包含艰难梭菌毒素的含水溶液包含艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B，并且在步骤(c)中，艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B从所述阴离子-交换载体单个洗脱。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述阴离子交换载体为基于非多糖的材料。

16.权利要求15中任一项的方法，其中所述阴离子交换载体为具有结合的季胺官能团的聚甲基丙烯酸酯树脂。

17.权利要求16中任一项的方法，其中所述阴离子交换载体包含强阴离子交换剂，部分-O-R-N⁺-(CH₃)₃，其中R为聚合物；和/或，阴离子交换载体为TosohSuperQ650M。

18.权利要求14-17中任一项的方法，其中毒素A使用低盐缓冲液洗脱。

19.权利要求19的方法，其中毒素A低盐缓冲液包含2-约32mMMgCl₂或约125-约160mMNaCl。

20.权利要求14-17中任一项的方法，其中毒素B使用高盐缓冲液洗脱。

21.权利要求20的方法，其中所述高盐缓冲液包含约120-约150mMMgCl₂或约450-约550mMNaCl。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述艰难梭菌毒素的不纯的含水溶液通过以下方法得到：在生长培养基中生长艰难梭菌的细胞，以提供含有艰难梭菌毒素和生长的细胞的培养物肉汤，和将培养物肉汤与生长的细胞分离，以提供艰难梭菌毒素的不纯的含水溶液。

23.权利要求22的方法，其中所述生长培养基包含山梨糖醇。

24.一种经纯化的艰难梭菌毒素，其根据权利要求1-12中任一项的方法得到，其中所述经纯化的艰难梭菌毒素的纯度为约90％或更大。

25.权利要求24的经纯化的艰难梭菌毒素，其中所述毒素的纯度为约94％或更大。