[发明专利]类毒素、组合物和相关的方法

说明书

相关的申请

本申请要求2013年3月15日提交的美国专利序号61/793,376的优先权，其通过引用而全文结合到本申请中。

本公开的领域

本公开一般性涉及蛋白质纯化领域。更具体地，本公开涉及经纯化的梭菌毒素、类毒素、包含经纯化的毒素或类毒素的组合物和制备经纯化的毒素和类毒素的方法。

本公开的背景

由培养物滤液制备的梭菌毒素需要广泛的纯化，以分离存在于滤液中的各种细胞组分(例如，细胞DNA、细胞蛋白质、培养基组分)，以适用于体内应用。的确，已开发多种纯化技术用于该目的。然而，根据这些技术制备的毒素可能仍含有明显量的过程中杂质。已进行各种努力以从培养物滤液纯化艰难梭菌(C.difficile)毒素A和毒素B。

在一种工艺中，通过超滤、离子交换层析法和乙酸沉淀纯化培养物滤液。通过该工艺，毒素B可仅被部分纯化，如通过当通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析时不能区分毒素与若干污染蛋白质而证明的。[Rothman，S.W.，等人，Curr.Microbiol.1981，6:221-224；Sullivan，N.M.，等人，Infect.Immun.，1982，35:1032-1040]。该工艺后来的修改涉及通过疏水相互作用层析法和离子交换层析法从艰难梭菌的渗析的滤液纯化毒素(RothmanS.W.，Infect.Immun.，1984，第324-331页)。然而，该工艺也不能提供毒素A和毒素B二者高度纯化的形式。

使用渗滤、硫酸铵沉淀和凝胶层析法(S-300Sephacryl尺寸排阻柱)从艰难梭菌培养物滤液共同纯化毒素A和B的方法在美国专利号6,969,520中描述。通过该方法制备的毒素的纯度为50%-60%(或更少，例如，44%)并且包括多种杂质(例如，约35kDa杂质，艰难梭菌3-羟基丁基(butryl)CoA脱氢酶，45-47kDa杂质(艰难梭菌谷氨酸脱氢酶)和60-70kDa蛋白质(groEL的同系物或蛋白质的细菌hsp60家族))。

目前可得的方法不适用于大规模生产。因此，本领域需要制备经纯化的毒素的备选方法。本公开提供用于以大规模提供经纯化的艰难梭菌毒素的方法。

本公开简述

本公开提供用于制备高度纯化的毒素和类毒素的方法。通过使用本文描述的方法，以纯化的形式并且以足够的收率得到艰难梭菌毒素和类毒素。在一些实施方案中，通过疏水相互作用层析法和阴离子交换层析法组合，任选在某些赋形剂存在下，通过由不纯的含水溶液纯化毒素，本公开提供用于生产艰难梭菌毒素的方法。在某些实施方案中，所述方法可包括使用基于非多糖的载体的阴离子交换层析法。在一些实施方案中，所述方法还可包括使用具有连接的苯基、丁基或丙基的疏水相互作用载体的疏水相互作用层析法。在一些实施方案中，不纯的含水溶液可经历超滤和/或渗滤步骤(例如，通过切向流过滤)。本文描述的方法以约≥90%(例如，约90%，约94%，约95-97%，约98%，约99%或更大)(例如，基本上不含杂质)的纯度水平提供毒素。经纯化的毒素可使用化学剂或本领域普通技术人员可得的其它方法(例如像，但不限于，甲醛、戊二醛或β-丙醇酸内酯(priopiolactone))灭活(例如，以产生类毒素)。还提供高度纯化的毒素和类毒素和包含这样的毒素或类毒素的组合物。这样的高度纯化的组分(和相关的组合物)可用于保护受试者免于症状艰难梭菌感染(例如，作为免疫组合物和/或疫苗)和/或治疗患有症状艰难梭菌感染的受试者(例如，作为免疫组合物和/或疫苗)。示例性方法、毒素、类毒素、其组合物及用途因此可包括但不限于在实施例中描述的那些。由本公开，其它实施方案对于本领域普通技术人员来说显而易见。

附图简述

图1.示例性毒素纯化工艺。

图2.类毒素的免疫原性。

详细描述