[发明专利]采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物

权利要求书

1.一种用于将基因修复寡核碱基(GRON)介导的突变引入细胞中的靶脱氧核糖核酸(DNA)序列中的方法，所述方法包括：

在将GRON递送至植物细胞中之前和/或同时在增加一种或多种细胞DNA修复过程的条件下培养所述细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中在GRON存在下增加一种或多种细胞DNA修复过程的所述条件包括以下中的一种或多种：将一个或多个位点引入至所述植物细胞DNA中，所述位点是用于碱基切除修复的靶标；将一个或多个位点引入至所述植物细胞DNA中，所述位点是用于非同源末端连接的靶标；将一个或多个位点引入至所述植物细胞DNA中，所述位点是用于微同源介导的末端连接的靶标；将一个或多个位点引入至所述植物细胞DNA中，所述位点是用于同源重组的靶标；以及将一个或多个位点引入至植物细胞DNA中，所述位点是用于引导和增加修复的靶标。

3.如权利要求1或2中的一项所述的方法，其中所述增加一种或多种细胞DNA修复过程的条件包括引入一种或多种化合物，所述化合物在将所述GRON递送至所述植物细胞中之前或同时诱导单链缺口或双DNA链断裂进入至所述植物细胞中。

4.如权利要求3所述的方法，其中诱导单链缺口或双DNA链断裂的所述一种或多种化合物包含一种或多种核酸酶和/或一种或多种博来霉素家族化合物。

5.如权利要求1-4中的一项所述的方法，其中诱导单链缺口或双DNA链断裂的所述一种或多种化合物共价偶联至所述GRON。

6.如权利要求1-5中的一项所述的方法，其中所述细胞是选自由以下组成的组的物种的植物细胞：芥花、向日葵、玉米、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、苜蓿、大麦、高粱、西红柿、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、土豆、胡萝卜、莴苣、洋葱、大豆、大豆属、甘蔗、豌豆、鹰嘴豆、紫花豌豆、蚕豆、扁豆、萝卜、芜菁甘蓝、球芽甘蓝、羽扇豆、花椰菜、羽衣甘蓝、菜豆、杨树、松树、桉树、葡萄、柑橘、黑小麦、苜蓿、黑麦、燕麦、草皮和牧草、亚麻、油菜、芥菜、黄瓜、牵牛花、香脂、辣椒、茄子、万寿菊、莲花、卷心菜、菊花、康乃馨、郁金香、鸢尾以及百合。

7.如权利要求1-6中的一项所述的方法，其中所述细胞是转基因的。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述靶DNA序列是所述细胞的内源基因。

9.如权利要求1-8中的一项所述的方法，其中所述细胞是植物细胞，并且其中所述方法还包括从所述植物细胞再生具有通过所述GRON引入的突变的植物。

10.如权利要求9所述的方法，其还包括从所述植物采集种子。

11.一种植物细胞，其包含根据权利要求1-80中的一项所述的方法由GRON引入的基因组修饰，或一种植物，其包含根据权利要求9所述的方法由GRON引入的基因组修饰，或一种种子，其包含根据权利要求10所述的方法由GRON引入的基因组修饰。

12.在细胞中，引入一种或多种化合物，所述化合物引入单链缺口或双链断裂以通过作为供体的基因修复寡核苷酸(GRON)改进突变转化。

13.一种评定GRON的转化效率的方法，其包括：

将所述GRON引入至表达编码蓝色荧光蛋白的靶DNA序列的植物原生质体中，其中所述GRON被构造成使所述靶DNA序列在预定位点处突变以引起所述蓝色荧光蛋白的转化，由此所述蓝色荧光蛋白发射不同波长的荧光，其中在引入所述GRON之前或同时，所述原生质体内的DNA与一种或多种化合物相接触，所述化合物将单链缺口或双链断裂引入至由所述GRON靶向的所述位点内的所述靶DNA序列；以及

测定所述转化的所述效率。

14.如权利要求13所述的方法，其中引入单链缺口或双链断裂的所述一种或多种化合物包含一种或多种核酸酶。

15.如权利要求13所述的方法，其中引入单链缺口或双链断裂的所述一种或多种化合物包含一种或多种博来霉素家族化合物。

16.如权利要求13-15中的一项所述的方法，其中所述靶DNA序列存在于所述原生质体的所述染色体DNA中。

17.如权利要求13-15中的一项所述的方法，其中所述靶DNA序列存在于质粒中。

18.如权利要求13-15中的一项所述的方法，其中引入单链缺口或双链断裂的所述一种或多种化合物提供相对于在不存在引入单链缺口或双链断裂的所述一种或多种化合物的情况下针对所述GRON测定的效率提高的转化效率。