[发明专利]采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物

说明书

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/801,320的优先权，所述专利申请特此以引用的方式并入。

发明领域

本发明总体上涉及用于改进对基因组或其他核苷酸序列中的特定位置的修饰的靶向效率的新颖方法。另外，本发明涉及已经通过本文所公开的方法修饰、突变或标记的靶DNA。本发明还涉及已经通过本发明的方法修饰的细胞、组织和生物体。

发明背景

DNA双链断裂(DSB)增强在活细胞中的同源重组并且已经用于通过使用工程化核酸内切酶靶向基因组编辑。工程化核酸酶的关键组分是DNA识别结构域，所述结构域能够将核酸酶引导至基因组的靶位点以用于基因组DNA双链断裂。由于非同源末端连接(NHEJ)所致的细胞DSB修复导致靶基因的诱变缺失/插入。或者，DSB可刺激内源性靶基因座与具有所需遗传信息的外源引入的同源DNA片段之间的同源重组，这是被称为基因靶向的一个过程。

涉及基因或基因组编辑的最有希望的方法是定制设计的锌指核酸酶(ZFN)，其是由锌指蛋白的DNA结合结构域和FokI核酸酶结构域(FN)组成的一种类型的杂交酶。ZFN技术主要涉及使用来源于锌指(ZF)蛋白的DNA结合结构域与核酸内切酶FokI的非特异性裂解结构域的杂合蛋白。ZF可被组装为进行定制设计以在于预先选定位点结合之后识别选定DNA序列的模块，DSB通过FokI的裂解结构域的作用产生。

首先从细菌海床黄杆菌分离FokI核酸内切酶。这种IIS型核酸酶由两个独立的结构域组成，N末端DNA结合结构域和C末端DNA裂解结构域。DNA结合结构域的功能是用于识别非回文序列5`-GGATG-375`-CATCC-3`，而催化结构域在所述识别位点下游9和13个核苷酸的固定距离处非特异性地裂解双链DNA。FokI作为无活性单体存在于溶液中，并且在结合其靶DNA且在一些二价金属的存在下变成活性二聚体。作为功能性复合物，FokI的各自结合双链DNA分子的两个分子通过DNA催化结构域二聚化以用于有效裂解DNA双链。

以类似的方式，还可通过使用其他蛋白质/结构域制备核酸酶，如果所述蛋白质/结构域能够特异性DNA识别。TAL效应子属于细菌蛋白的一大群体，其存在于黄单胞菌属的不同菌株中并且通过III型分泌系统(所谓的Ⅲ型效应子)易位至宿主细胞中。一旦在宿主细胞中，一些TAL效应子已被发现针对菌株毒力(引起疾病的能力)或无毒力(触发宿主抗性反应的能力)转录活化其对应宿主靶基因，这取决于宿主遗传背景。每个效应子包含为真核转录活化因子的特征的功能性核定位基序和有效转录活化结构域。并且每个效应子还含有由34个氨基酸的不同数目的重复单位组成的中心重复区域，且作为DNA结合结构域的重复区域决定每个效应子的生物学特异性。

Zhang等,PlantPhysiol.161:20-27,2013(其以引用的方式整体并入本文)公开了使用TALEN(转录活化因子样效应子核酸酶),其是基于TAL效应子样DNA结合结构域与FokI的催化结构域的组合的工程化的核酸内切酶。通过工程化DNA结合结构域，这些TALEN据报道可容易地设计来识别特异性DNA结合结构域。使用烟草原生质体作为模型系统，使用包含连接至TALEN识别位点的黄色荧光蛋白编码序列的单链退火多核苷酸报道基因评定TALEN活性。将此报道基因系统递送至原生质体，并且可通过功能性YFP的表达来测量裂解和修复事件。

发明概述

在第一方面，本发明涉及用于将基因修复寡核碱基(GRON)介导的突变引入至植物细胞中的靶脱氧核糖核酸(DNA)序列中的方法。所述方法尤其包括在将GRON递送至植物细胞中之前和/或同时在增加一种或多种细胞DNA修复过程的条件下培养植物细胞。

在某些实施方案中，增加一种或多种细胞DNA修复过程的条件包括以下中的一种或多种：将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA中，所述位点是用于碱基切除修复的靶标；将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA中，所述位点是用于非同源末端连接的靶标；将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA中，所述位点是用于微同源介导的末端连接的靶标；将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA中，所述位点是用于同源重组的靶标；以及将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA中，所述位点是用于推动修复的靶标。

在某些实施方案中，靶脱氧核糖核酸(DNA)序列是在植物细胞基因组内。植物细胞可以是非转基因或转基因的，并且靶DNA序列可以是所述植物细胞的转基因或内源基因。