[发明专利]生物样品的稳定化

说明书

引起本发明的工作得到欧洲共同体第七框架计划(EuropeanCommunity'sSeventhFrameworkProgramme)(FP7/2007-2013)的资助，资助协议号为222916。

技术领域

本文所公开的技术尤其涉及适于使含细胞样品、特别是血液样品稳定化的方法和组合物，并且涉及用于从相应稳定化的生物样品中分离核酸的方法。

背景技术

核酸是诊断领域中的重要生物标志物。例如基因组转录物(特别是mRNA和miRNA)的概况被广泛用作分子体外诊断学中的生物标志物并提供对于正常生物和病理过程的内部了解以希望预测疾病结果和指示个性化治疗过程。因此，核酸、特别是RNA的概况分析在疾病诊断、预后中以及在关于生物标志物发现的临床试验中是重要的。从转录概况获得定量信息的能力，对于探索基础生物学，诊断疾病，促进药物开发，对于特定病理学和遗传图谱定制治疗方法以及产生与生物或治疗过程和途径相关的数据库，是一种强大的工具。在过去几年中已经对下游测定法和数据分析(分析过程)作出了显著改进。然而，已发现，分析前步骤，例如样品处理和样品稳定化，特别是对于新的生物分子靶标来说，对于表达概况具有严重的影响并且可能损害后续分析(参见例如等,2001,Pahl和Brune,2002)。在待分析样品的稳定化中不存在预防措施的情况下，样品在运输和储存期间将经历变化，其可能严重改变目标分子的表达概况(参见例如Rainen等,2002；Baechler等,2004)。因此，基因表达、特别是血细胞基因表达对于样品的离体处理是敏感的。如果表达概况由于样品的处理而改变，则后续分析不反映样品以及因此患者的原始状况，而是度量在样品处理、运输和储存期间产生的人工概况。因此，需要优化的稳定化过程，其稳定化表达概况，从而允许可靠的分析。特别是，需要稳定化血液样品以允许血细胞基因表达谱的分析。

在形式上通过添加有机溶剂如苯酚和/或氯仿或通过在液氮中直接冷冻或使用干冰来进行样品如特别是血液样品在较长时期内的稳定化。这些方法完全不是医院、医生手术或诊断常规实验室可实行的技术。为了克服这些问题，PreAnalytiX开发了利用真空血液采集管来采集人类血液的第一个研究产品，所述真空血液采集管含有用于在样品采集点立即对RNA基因表达谱进行稳定化的试剂(PAXgene全血RNA管)。相应的稳定化组合物允许在室温下运输和储存而不存在RNA概况由于基因诱导和转录物降解而改变的风险(参见例如US6,617,170；US7,270,953；Kruhoffer等,2007)。实现样品(这里是血液)的立即裂解的其它稳定化试剂由ABI/LifeTechnologies以名称Tempus全血RNA管产品销售。另一种产品是BiomatricaVacuetteRNAgard血液管。此外利用这种管，在采集期间立即发生裂解并且随着血液温育时间推移由完整RNA显示RNA酶失活。相应方法的缺点在于，稳定化导致细胞的完全裂解。细胞的破坏导致，胞内核酸变得与胞外核酸混合，这阻止这两种核酸群体的独立分析。此外，不仅分离核酸的质量和数量或其表达概况，而且样品例如血液样品中所含的特定细胞的存在、不存在或数目均是分析所感兴趣的。细胞的破坏是一个很大的缺点，因为任何细胞分选或细胞富集或细胞分析变得不可能。

因此，常常提供特定预期用于细胞稳定化的特定稳定化试剂或血液采集管。相应产品允许研究样品在储存后的细胞内含物，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析来检测肿瘤细胞的存在，或通过流式细胞术(FC)或FACS分析来检测不同白血球彼此的比率变化。例如许多工作流使用标准EDTA血液采集管以用于流式细胞术或FACS分析，尽管随着储存时间推移，血细胞显示轻微裂解。来自StreckInc.的另一种产品是直抽式真空血液采集管，其用于保存全血样品以供通过流式细胞术进行免疫表型分析。它保存白血球抗原，这允许白血球子集通过流式细胞术分析加以区分。维持白血球分化簇(CD)标志物的完整性的技术例如由US5,460,797和US5,459,073涵盖。

然而，使用不同的稳定化试剂和相应地使用用于采集供核酸分析和细胞分析的样品的稳定化管是冗长的。需要减少在患者位置处每抽一次而专用于不同下游测定法(例如细胞检测和RNA分析)的不同样品采集管、例如血液采集管的数目。因此，需要样品采集和稳定化系统，其保存细胞的形态，而同时将核酸稳定化。