[发明专利]核酸扩增

权利要求书

1.一种生成包含双链核酸模板的两个或更多个拷贝的多联体的方法，该方法包括：

(A)在使得合成与双链核酸模板的第一链退火的第一引物的第一拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第一拷贝和聚合酶处理包含双链核酸模板的一级双链核酸，

其中

第一引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：

(i)尾区，其包含：

(a)引物的5’末端核苷酸

(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游

(c) 5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及

(ii)模板结合区，其包括

(a)引物的3’末端核苷酸

(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游

(c) 3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且

第一引物的第一拷贝的模板结合区与双链核酸模板的第一链退火，

(B)在使得合成与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火的第二引物的延伸产物的条件下，用第二引物和聚合酶处理步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物，

其中

第二引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：

(i)尾区，其包含

(a)引物的5’末端核苷酸

(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游

(c) 5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及

(ii)模板结合区，其包含

(a)引物的3’末端核苷酸

(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游

(c) 3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，

第二引物的模板结合区与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火，并且

第二引物的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第二引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且该3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，

(C)在使得合成与步骤(B)的第二引物的延伸产物退火的第一引物的第二拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第二拷贝和聚合酶处理步骤(B)的第二引物的延伸产物，以产生包含步骤(B)的第二引物的延伸产物和第一引物的第二拷贝的延伸产物的二级核酸的第一拷贝，

其中

第一引物的第二拷贝的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第一引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且该3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，

(D)将至少步骤(C)重复另外一次或多次以生成步骤(C)的二级核酸的至少第二拷贝，

(E)在使得二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的3’末端区与二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的3’末端区退火的条件下，处理步骤(C)的二级核酸的第一拷贝以及步骤(D)的二级核酸的第二拷贝，以产生包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的交换结构，

(F)在使得合成二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及合成二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物的条件下，用聚合酶处理步骤(E)的交换结构，以产生包含步骤(A)的双链核酸模板的两个拷贝的多联体，其中该多联体包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物；

其中如果第一引物和第二引物的序列对齐，使得第二引物的5’末端核苷酸与第一引物的尾区的最内核苷酸对齐并且第一引物的5’末端核苷酸与第二引物的尾区的最内核苷酸对齐，则第二引物的尾区含有与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(A)的核酸聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶。

3.如权利要求1所述的方法，其中该方法的所有步骤均在不高于80 ^oC的温度下进行。