[发明专利]核酸扩增

说明书

本文公开了用于核酸扩增和多联体生成的方法和组合物。本文提供的扩增方法可以在等温条件下进行。方法和组合物可以包括诸如核酸聚合酶和引物等试剂。

背景技术

对于用于核酸扩增的方法和试剂的需求日益增加。生成特定核酸的多个拷贝通常是必要的或有用的，以便核酸可用于给定的应用。例如，为了分析感兴趣的核酸的核苷酸序列，在分析该序列之前经常复制核酸以增加它的拷贝数。在另一个实例中，为了确定样品中特定核酸的存在或不存在，可在一定条件下处理样品以使得如果特定核酸存在于该样品中则它可被扩增。在另一个实例中，用作探针的核酸可进行重复拷贝以生成大量含有与原始核酸模板相同的序列的核酸，从而生成核酸的许多拷贝，该拷贝可用作探针。

已知多种用于核酸扩增的方法。例如，聚合酶链反应(“PCR”)(参见，例如，美国专利号4,683,202)是一种用于核酸扩增的普遍方法。为了成功地进行PCR反应，该反应必须在重复多个循环的多个不同温度下进行。这需要用于重复地改变PCR反应的温度的硬件或其他机构。用于核酸扩增的另一种方法被称为环介导等温扩增(“LAMP”)(参见，例如，美国专利号6,410,278)。LAMP反应可在等温下进行，但通常包括四种不同引物的使用，这些引物识别靶核酸上总计六种不同的序列。

为促进生成扩增的核酸以用于使用扩增的核酸的多个和增加数量的应用，需要用于核酸扩增的新的方法和试剂。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而以相同程度并入本文，犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。然而，在本公开的内容与本文通过引用并入的文献的内容之间冲突的情况下，以本公开的内容为准。

发明内容

本文提供了涉及核酸扩增和多联体生成的方法和组合物。

在一些实施方式中，本文提供了用于生成包含双链核酸模板的两个或更多个拷贝的多联体的方法，该方法包括：(A)在使得合成与双链核酸模板的第一链退火的第一引物的第一拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第一拷贝和聚合酶处理包含双链核酸模板的一级双链核酸，其中第一引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包括：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且第一引物的第一拷贝的模板结合区与双链核酸模板的第一链退火，(B)在使得合成与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火的第二引物的延伸产物的条件下，用第二引物和聚合酶处理步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物，其中第二引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包含：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，第二引物的尾区包含与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列，如果将所述序列对齐使得第二引物的5’末端核苷酸与第一引物的尾区的最内核苷酸对齐并且第一引物的5’末端核苷酸与第二引物的尾区的最内核苷酸对齐，第二引物的模板结合区与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火，并且第二引物的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第二引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，(C)在使得合成与步骤(B)的第二引物的延伸产物退火的第一引物的第二拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第二拷贝和聚合酶处理步骤(B)的第二引物的延伸产物，以产生包含步骤(B)的第二引物的延伸产物和第一引物的第二拷贝的延伸产物的二级核酸的第一拷贝，其中第一引物的第二拷贝的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第一引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且该3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，(D)将至少步骤(C)重复另外一次或多次以生成步骤(C)的二级核酸的至少第二拷贝，(E)在使得二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的3’末端区与二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的3’末端区退火的条件下，处理步骤(C)的二级核酸的第一拷贝以及步骤(D)的二级核酸的第二拷贝，以产生包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的交换结构，(F)在使得合成二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及合成二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物的条件下，用聚合酶处理步骤(E)的交换结构，以产生包含步骤(A)的双链核酸模板的两个拷贝的多联体，其中该多联体包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物。