[发明专利]包含修饰铰链区的IgG4FC片段

说明书

[技术领域]

本发明涉及可用作药物载体的IgG4Fc片段，更具体地涉及可以最小化Fc的效应子功能(effectorfunctions)，但不引起与体内IgG进行链交换，并且可以提高缀合药物的体内半衰期的IgG4Fc片段。

[背景技术]

遗传工程技术的进步已经造就各种蛋白质药物的制造和使用。但是，蛋白质药物的致命问题在于，其因体内蛋白酶而容易变性或容易分解，因此无法长时间维持其体内浓度和滴定度。因此，为了给患者提供有效治疗同时减少患者接受通过注射等进行的频繁蛋白质供应的负担和其费用，通过增加蛋白质稳定性使蛋白质药物的血液和体内浓度维持在适当水平是非常重要的。

因此，为提高蛋白质药物的体内稳定性，长久以来已做过很多尝试——通过改变蛋白质的制剂类型、与其它蛋白质融合、或通过化学或生物学方法将合适的聚合物附着于蛋白质表面上。

其中一种通过与其它蛋白质融合来提高蛋白质稳定性的尝试是进行免疫球蛋白Fc和蛋白质之间的融合。

Fc区，除抗原结合能力(免疫球蛋白的主要功能)之外，还负责效应子功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，存在于Fc区的FcRn序列具有通过缀合至体内FcRn受体来增加体内半衰期而调节血清中的IgG水平的作用。关于这点，已经通过Fc区与治疗性蛋白质之间的融合进行了积极的研究来改良治疗性蛋白质。

但是，通过遗传重组产生的Fc融合蛋白的缺点在于：蛋白质融合仅在Fc区的特定区域可能发生，即氨基末端或羧基末端，且仅在糖基化蛋白质之间或非糖基化蛋白质之间可能发生，但在糖基化蛋白质和非糖基化蛋白质之间不可能发生。此外，通过遗传重组产生的Fc融合蛋白的问题在于：由于通过融合新产生的氨基酸序列可导致免疫应答发生，以及蛋白酶对连接体区域的敏感性可能增加。

此外，Fc融合蛋白具有增强的靶蛋白血清半衰期，但同时其也存在问题：Fc区具有的效应子功能显现(美国专利号5,349,053)。通过Fc区的效应子功能，融合蛋白可以固着补体或结合至FcRs表达细胞以破坏特定细胞，和诱导引发炎症的多种细胞因子生成和分泌，从而引发炎症。另外，融合区域中的蛋白质序列是在人体中不存在的新蛋白质序列，因此其具有多种缺点，包括在长期施用的情况下可能诱导免疫应答。

因此，研究已致力于采用其中效应物功能被删除同时血清半衰期得到保持的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。Cole等先前报道，通过用丙氨酸取代CH2结构域中的第234、235和237位残基(已知其在结合Fc受体方面具有重要作用)来抑制ADCC活性，以生产Fc受体亲和力降低的Fc衍生物，(Cole等，J.Immunol.159：3613-3621，1997)。但是，所有的这些都具有不适合的、与天然人Fc区不同的氨基酸，因此可具有更高的免疫性或抗原性，并且优选的Fc功能可能丧失。

作为在保持高血浓度免疫球蛋白的同时去除或减少不需要的效应子功能的方法，一种去除免疫球蛋白中的糖类的方法得到研究。在美国专利号5,585,097中，通过在制备CD3抗体时使CH2结构域的第297位天冬酰胺残基(CD3抗体的糖基化残基)被另一氨基酸取代，制备了非糖基化的抗体衍生物，并且具体地，该衍生物显示出降低的效应子功能，同时保持与FcRn受体的结合力，并且不改变其血清半衰期。但是，该方法也存在问题，由于新的重组构建体生成，其可能被免疫系统识别为外来物质并因此被免疫系统排斥。

在利用天然IgGFc的序列制备融合蛋白质时，可选择IgG4Fc，以最小化Fc的效应子功能。已知IgG4具有与IgG1相似的体内半衰期，但由于氨基酸序列差异而具有相对小的效应子功能。然而，尽管IgG4具有效应子功能降低的优势，但由于其独特的铰链序列，IgG4之间可发生体内链交换，因此据报道，将融合蛋白质用于治疗目的时存在很大困难(vanderNeutKolfschoten等,Science,317:1554-1557,2007)。也就是说，存在如下问题：当IgG4Fc被用作蛋白质融合的载体时，与体内存在的IgG4发生链交换，从而与天然IgG4形成杂合体，或者其可以单体形式存在，从而改变原始结构并具有低治疗活性的结构。通过遗传工程或在体外是否生成IgG4Fc片段和生理活性物质之间的融合产物是一个普遍问题。

[发明内容]

[技术问题]