[发明专利]制备成熟胰岛素多肽的方法

权利要求书

1.一种包含序列Z-B-X-Y-A的胰岛素前体，其中

-Z是任选的延伸序列，

-B是人胰岛素或其类似物的B-链，

-X是AM，

-Y是K或R，和

-A是人胰岛素或其类似物的A-链。

2.权利要求1的胰岛素前体，其中Y是K。

3.权利要求1的胰岛素前体，其中Y是R。

4.权利要求1的胰岛素前体，其中A是A(1-21)和B是B(1-29)。

5.权利要求1的胰岛素前体，其中选择A和B，使得所述胰岛素前体是B28D人胰岛素、B28K,B29P人胰岛素、B3K,B29E人胰岛素、或A21G,B31R,B32R人胰岛素的前体。

6.权利要求1-5中任一项的胰岛素前体，其中Z是EEGEPK。

7.权利要求1-5中任一项的胰岛素前体，其中Z选自EEAEPK和EEAEAEAPK。

8.制备成熟人胰岛素或其类似物的方法，所述方法包括(i)在表达所述人胰岛素或人胰岛素类似物的前体的合适培养条件下，培养包含编码权利要求1-7中任一项的人胰岛素或其类似物的前体的DNA序列的真菌细胞；和(ii)分离所表达的前体。

9.在真菌细胞中表达期间降低人胰岛素或人胰岛素类似物的前体的O-糖基化的方法，所述方法包括(i)在表达所述人胰岛素或人胰岛素类似物的前体的合适培养条件下，培养包含编码权利要求1-7中任一项的人胰岛素或其类似物的前体的DNA序列的真菌细胞。

10.在真菌细胞中表达期间增加人胰岛素或人胰岛素类似物的前体的收率的方法，所述方法包括(i)在表达所述人胰岛素或人胰岛素类似物的前体的合适培养条件下，培养包含编码权利要求1-7中任一项的人胰岛素或其类似物的前体的DNA序列的真菌细胞。

11.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述真菌细胞中的PMT1基因和PMT2基因都缺失。

12.权利要求8-10中任一项的方法，其中编码人胰岛素或人胰岛素类似物的前体的所述DNA序列包含前导序列。

13.权利要求12的方法，其中所述前导序列为α-因子信号前导序列。

14.权利要求12的方法，其中所述前导序列选自α2、α4、LA19和TA39。

15.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述真菌细胞是酵母。

16.权利要求15的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。

17.权利要求15的方法，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母。

18.权利要求15的方法，其中所述酵母是多形汉逊氏酵母。

19.多核苷酸，其编码权利要求1-7中任一项的人胰岛素或人胰岛素类似物的前体。

20.表达载体，其包含权利要求19的多核苷酸。

21.宿主细胞，其被权利要求20的载体转化。