[发明专利]制备成熟胰岛素多肽的方法

说明书

本发明涉及制备成熟人胰岛素或其类似物的改善的方法，即通过培养包含编码人胰岛素或其类似物的前体的DNA序列的真菌细胞，所述前体包含小的连接肽。

技术背景

本发明涉及制备成熟胰岛素多肽的重组蛋白表达和蛋白化学。

背景

胰岛素是在胰岛β细胞中产生的多肽激素。有活性的胰岛素分子是由通过两个二硫键相连的B-链和A-链组成的双链分子。胰岛素以结构为B-C-A的前体分子胰岛素原形式合成，其中C-肽链将B-链的C-末端氨基酸残基与A-链的N-末端氨基酸残基相连。成熟的双链胰岛素通过在位于与A-链和B-链的接点处的碱性氨基酸残基对处体内切割C-肽而形成。A-链和B-链通过分别位于A7和B7以及A20和B19 Cys残基之间的两个二硫键保持在一起。此外，生物学活性的胰岛素分子在A6和A11位Cys残基之间有一个内部二硫键。

已经描述了在基因修饰宿主细胞例如大肠杆菌和酵母中生产胰岛素及其前体的许多方法。在大多数酵母工艺中，具有或天然C-肽或修饰的C-肽的胰岛素前体被表达和从酵母细胞中分泌出来。WO90/10075公开了具有C-肽AAK的胰岛素前体。WO01/49742公开了具有包含芳族氨基酸残基的C-肽的胰岛素前体。WO02/079251公开了具有包含Gly残基的C-肽的胰岛素前体。WO02/079250公开了具有包含Pro残基的C-肽的胰岛素前体。WO02/100887公开了具有包含糖基化位点的C-肽的胰岛素前体。WO2008/037735公开了具有包含kex2p切割位点的C-肽的胰岛素前体。WO2011/099028公开了降低在毕赤酵母(Pichia sp)中产生的胰岛素或胰岛素类似物前体分子的O-糖基化水平的方法。

如果没有直接获得成熟胰岛素或胰岛素类似物产物，则在一个或多个后续的体外酶促步骤中通过切割C-肽和可能的N-末端延伸而获得。这些酶促步骤是耗时的，常常是昂贵的，并且具有引入额外相关杂质(即类似成熟的胰岛素多肽的杂质)的风险。胰岛素多肽的酵母表达的另一个挑战是胰岛素多肽的O-糖基化。O-糖基化胰岛素多肽也是相关杂质。对于所有相关杂质而言相同的是，它们在技术上难以除去，并由此在商业纯化工艺中除去花费多。这是因为需要额外的纯化步骤，通常是色谱步骤，或需要在经济上不利的条件下操作色谱步骤。相关杂质的结果是，这样的色谱步骤可能在较长周期内、较低的柱载量、或甚至较低的收率下操作。

在制药工业中胰岛素产品越来越多地由胰岛素多肽的衍生物构成并且这类药物产品越来越多地用于非注射递送。因此，胰岛素市场已经变成竞争性市场并变为每一剂需要更多胰岛素多肽的产品，所以需要成本上更有效的工艺用于制备胰岛素多肽。

因此，需要在工业生产工艺中通过真菌制备人胰岛素或其类似物，其胰岛素前体分子具有减少的O-糖基化。也需要具有胰岛素前体的较高收率并且可通过有效和简单的工艺使得胰岛素前体顺从于C-肽的蛋白水解切除的工业生产工艺。

概述

本发明提供新的连接肽(C-肽)，当其在转化的微生物、尤其是酵母中表达时，赋予胰岛素前体分子的高收率。新的连接肽当在真菌例如酵母中表达时也促进通常低水平的O-糖基化。在具有降低O-糖基化能力的真菌菌株中表达新的胰岛素前体进一步降低了所表达的O-糖基化的胰岛素前体的比例。这类胰岛素前体随后可通过一个或多个合适的、公知的转化步骤而转化为人胰岛素、desB30人胰岛素、其它胰岛素类似物或某些胰岛素衍生物。

依据本发明的第一方面，提供了制备成熟人胰岛素或其类似物的方法，即通过培养包含编码人胰岛素或其类似物的前体的DNA序列的真菌细胞，所述前体具有序列Z-B-X-Y-A，其中

- Z是任选的延伸序列，

- B是人胰岛素或其类似物的B-链，

- X是选自以下的序列：X₁M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X₁是包含1-3个氨基酸残基的序列，