[发明专利]用于表达肽和蛋白的方法

权利要求书

1.用于生产目的重组肽(PeOI)或目的蛋白(PrOI)的方法，其中所述方法包括：

(a)将编码融合蛋白的核酸分子引入宿主细胞中，所述融合蛋白包含至少一个PeOI或 PrOI和至少一个I型分泌系统(T1SS)转运物或其片段，其中所述宿主细胞不表达所述T1SS 的异源ATP结合盒(ABC)转运子、异源膜融合蛋白(MFP)和/或异源外膜蛋白(OMP)；

(b)在允许所述融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，其中所述融合蛋白的表达形 式为包涵体(IB)；

(c)从所述宿主细胞中分离出重组融合蛋白；和

(d)令所述重组融合蛋白接触允许所述PeOI或PrOI折叠为功能性三维构象的条件。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T1SS转运物选自：HlyA,CyaA,EhxA, LktA,PILktA,PasA,PvxA,MmxA,LtxA,ApxIA,ApxIIA,ApxIIIA,ApxIVA,Apxl,ApxII, AqxA,VcRtxA,VvRtxA,MbxA,RTX细胞毒素,RtxLl,RtxL2,FrhA,LipA,TliA,PrtA,PrtSM, PrtG,PrtB,PrtC,AprA,AprX,ZapA,ZapE,Sap,HasA,大肠杆菌素V,LapA,ORF,RzcA,RtxA, XF2407,XF2759,RzcA,RsaA,Crs,CsxA,CsxB,SlaA,SwmA,S111951,NodO,PlyA,PlyB, FrpA,FrpC。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述T1SS转运物是HlyA，该HlyA 包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列、其片段、或与SEQIDNO:2所示氨基酸序列或其片段具 有至少80％序列一致性的多肽，或者该HlyA由SEQIDNO:2所示氨基酸序列、其片段、或 与SEQIDNO:2所示氨基酸序列或其片段具有至少80％序列一致性的多肽组成。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述HlyA的所述片段由SEQIDNO:4所 示氨基酸序列或与SEQIDNO:4所示氨基酸序列具有至少80％序列一致性的多肽组成。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，其中表达培养基包含20.0mM 或以下的Ca²⁺。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞中，所述T1SS 的内源ABC转运子基因、内源MFP基因和/或内源OMP基因的表达，或其相应基因产物的 活性，受到抑制或转运低效。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞不表达所述T1SS的内源ABC 转运子，内源MFP和/或内源OMP。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤(d)中，所述重组 多肽或蛋白暴露在复性缓冲液中，其中所述复性缓冲液包含至少0.01mM的Ca²⁺。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，

(I)所述宿主细胞为原核细胞；和/或

(II)所述表达在基本培养基中进行；和/或

(III)使用选自亲和层析、离子交换层析、反相层析、体积排阻色谱及其组合的方法对 所述重组融合多肽或蛋白进行纯化；和/或

(IV)所述方法包括又一步骤(e)，其中令所述重组融合蛋白接触用于裂解所述融合蛋 白以生成作为分离分子的所述转运物和所述肽或PrOI的蛋白酶；和/或

(V)所述方法包括又一步骤(e)，其中通过化学处理裂解所述重组融合蛋白，以生成 作为分离分子的所述转运物和所述PeOI或PrOI；和/或

(VI)所述方法包括如(IV)或(V)所限定的步骤(e)，其后还对所述PeOI或PrOI 进行纯化。