[发明专利]用于表达肽和蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、重组肽和蛋白表达领域，且涉及包含含有T1SS底物/转运物或 其片段的核苷酸序列用于高效生产目的重组肽和蛋白的方法。所述转运物或其片段促进目的 重组肽和蛋白作为包涵体(IB)的表达，可充当IB标记。

背景技术

近年来，重组蛋白/酶的生产在工业生产过程中的用途已变得越来越重要，且可以预期许 多工业过程即将涉及重组技术。目前，生物活性肽和蛋白用作各种疾病中的治疗剂，例如， 糖尿病(胰岛素)，病毒感染和白血病(干扰素)，免疫系统疾病(白介素)，和红血细胞 不足(红细胞生成素)。此外，各种工业应用中需求大量蛋白和肽，包括，例如，纸浆和造 纸工业，纺织业，食品行业，个人护理和化妆品工业，糖精制，废水处理，酒精饮料生产和 用于生产新药物的催化剂。

然而，重组肽和蛋白的表达仍然受限，要获得大量、高纯度且天然折叠的期望的肽和蛋 白需要付出巨大努力。

通常，由于特性类似的蛋白难以区分，产品的纯化是昂贵的，特别是达到100％纯度的 最后一步，容易成倍增加费用(Hacking,A.J.(1986)Economicaspectsofbiotechnology, CambridgeUniversityPress)。

在许多情况下，表达不溶形式的蛋白或肽是有用的，尤其是当目的肽(PeOI)或蛋白(PrOI) 相当短、通常为水溶性和/或在宿主细胞内面临蛋白降解时。生产不溶形式的肽，既便于简单 回收，又保护肽不遭受蛋白降解。一种用于生产不溶形式的肽的方法，是通过在所述融合肽 中包括至少一种诱导IB形成的溶解性标记(即，包涵体(IB)标记)，从而重组产生作为不 溶融合肽/蛋白的一部分的肽。典型地，融合蛋白设计为包括至少一个可裂解的肽接头，从而 使得PeOI或PrOI可随后从融合蛋白中回收。该融合蛋白可被设计为包括多个IB-标记，可裂 解肽接头和编码PeOI或PrOI的区域。

促进不溶性蛋白表达且包含肽标记的融合蛋白是公知的现有技术。通常，所述嵌合或融 合蛋白的标记部分大，增加该融合蛋白的不可溶可能性。通常使用的大肽的例子包括但不限 于：氯霉素乙酰转移酶acetyltransferase(Dykesetal.,(1988)Eur.J.Biochem.,174:411)，β半乳 糖苷酶(Schellenbergeretal.，(1993)Int.J.PeptideProteinRes.，41:326；Shenetal.，(1984)Proc. Nat.Acad.Sci.USA281:4627；和Kempeetal.,(1985)Gene,39:239)，谷胱甘肽S-转移酶(Ray etal.,(1993)Bio/Technology,11:64andHancocketal.(WO94/04688))，L-核酮糖激酶的N端 (美国专利5206154和Laietal.,(1993)Antimicrob.Agents&Chemo.,37:1614)，噬菌体T4 gp55蛋白protein(Grammetal.,(1994)Bio/Technology,12:1017)，细菌酮类固醇异构酶蛋白 (Kuliopulosetal.,(1994)JAm.Chem.Soc.116:4599和美国专利5648244)，泛素(Pilonetal., (1997)Biotechnol.Prog.,13:374-79)，牛凝乳酶原(Haughtetal.,(1998)Biotechnol.Bioengineer. 57:55-61)，和杀菌/渗透性增强蛋白("BPI"；Better,M.D.andGavit,PD.，美国专利6242219)。 本领域中存在大量该技术的具体例子，例如参见美国专利6037145，其中教导了一种保护已 表达嵌合蛋白不受特定蛋白酶影响的标记；美国专利5648244，其中教导了具有便于期望蛋 白纯化的标记和裂解接头的融合蛋白的合成；和美国专利5215896、5302526；5330902；和 美国专利申请公开No.2005/221444，其中描述了包含专门设计用于增加嵌合蛋白或肽不溶性 的氨基酸组合物的融合标记。

然而，本领域中已知的方法没有提供任何解决PeOI或PrOI复性的方法。因此，本领域 中仍需要能够改进重组PeOI和PrOI生产的方法。