[发明专利]低pH的HNL突变体

说明书

本发明涉及新鉴定的(R)-选择性羟基腈裂解酶(R-HNL)突变体，特别地PaHNL5(Prunusamygdalus的羟基腈裂解酶同工酶5)的变体，其在极低的pH下(即，在2.5左右和更低的pH下)稳定。特别地，本发明提供编码所述突变酶的核酸、重组微生物和它们用于工业应用的用途。

泛酸内酯(pantolactone)外消旋物可由羟基新戊醛、氰化钠、盐酸和氯化钙通过化学反应来制备。化学工业中对于制造(R)-泛酸内酯有很大兴趣，因为它在(R)-泛酸钙和(R)-泛醇合成中很重要。这两种化合物代表维生素B5前体并广泛应用于食品、化妆品和药物中。

对于对映体纯(enantiopure)的(R)-氰醇((R)-cyanohydrins)(例如，(R)-泛酸内酯)的工业生产，从经济和生态这两方面而言，使用从蔷薇(Rosaceae)科植物分离的R-HNL(例如，来自Prunusamygdalus的同工型5(PaHNL5))相较于其中外消旋物被化学转化为(S)-或(R)-泛酸内酯的化学拆分步骤优选。

建立包含R-HNL催化的不对称氢氰化反应步骤的工业生产方法非常有挑战：首先，所述不对称反应必须与背景中存在的自发外消旋氢氰化反应竞争。这种“背景反应”仅可以通过将温度降低至25℃-15℃左右来减缓且在低pH值(例如pH低于2)下几乎被抑制。其次，不对称氢氰化仅在各底物以单体形式存在时才可能。然而，羟基新戊醛在室温和低于室温下在水中形成稳定的二聚体，其不能被用作底物。只有苛刻的低于2的酸性pH(例如，pH为1左右)看起来有利于单体形式，这与使用标准酶的生物转化极不相容。还可以通过应用高温(例如，至少65℃)或在水中高度稀释底物来水解二聚体，这些条件同样与HNL-催化的不对称氢氰化反应不相容。因此，在将底物加入酶促反应混合物中之前，利用高温和低pH条件来产生活性单体形式的二聚体形式的底物的“预单体化”步骤是必要的。

能够催化羟基新戊醛朝向相应的(R)-氰醇(其可通过酸催化的水解被进一步转化为(R)-泛酸内酯)的立体选择性转化的天然R-HNL酶已被知晓超过15年(参见例如，Effenberger等人，Tetrahedron：Asym.1995，6，271-282)。天然(R)-HNL制剂递送(R)-泛酸内酯的产率(84％)和选择性(即，对映体过量(89％ee))均不足。此外，这些酶在低pH下不稳定且需要使用有机溶剂。

成熟PaHNL5酶序列中第317位氨基酸的替换产生重组酶PaHNL5_V317A(参见WO2008/071695)，在低pH下和水中，其的羟基新戊醛朝向相应的(R)-氰醇的转化为使用天然酶时的13倍。然而，由于其在pH2.5时的半稳定性持续较长的时期，所以在上述苛刻条件下，其对于工业方法仍然不是非常有效。

因此，持续需要在低pH和低温下有活性且稳定的R-HNL变体以进行各底物的不对称氢氰化，例如羟基新戊醛朝向相应的(R)-氰醇，同时避免与不对称反应竞争的背景反应和二聚体形成。

出乎意料地，我们现在鉴定出了对R-HNL在上述条件(例如，建立(R)-泛酸内酯立体选择性生产的工业方法所需的2.5左右的pH和在l5-25℃的温度)下的稳定性和活性起重要作用的氨基酸位置。已基于SEQIDNO：1所示的成熟PaHNL5产生了重组酶，其在第317和496位带有氨基酸替换，其中SEQIDNO：1对应于EP1223220中的SEQIDNO：20或者图3所示的第28-559位氨基酸，即，仍然包括对应于EP1223220图3中的前27个氨基酸的信号序列。因此，本申请中所述的第317和496位分别对应于EP1223220的SEQIDNO：20中所示的第344和523位。