[发明专利]多能干细胞向多能肾前体分化的方法

权利要求书

1.将诱导的多能干细胞分化成表达SIX2的肾前体细胞的方法，该方法包括步骤：

a)在多能培养基中提供多能干细胞单层，

b)在补充有糖原合酶激酶3的小分子抑制剂和重组骨形态发生蛋白-4的引发培养基中温育细胞，其中所述糖原合酶激酶3的小分子抑制剂是3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮，

c)通过在诱导培养基中温育引发的细胞诱导分化，其中所述诱导培养基是补充有重组骨形态发生蛋白-7和视黄酸的无血清培养基；

其中

步骤a)包括在多能培养基中温育细胞18小时到30小时，

步骤b)包括在引发培养基中温育细胞2到4天，

步骤c)包括在诱导培养基中温育细胞18到48小时；

并且

(i)所述糖原合酶激酶3的小分子抑制剂的浓度为0.5-4μM；

(ii)所述重组骨形态发生蛋白-4的浓度为10-50ng/ml；

(iii)所述重组骨形态发生蛋白-7的浓度为20-80ng/ml；

(iv)所述视黄酸的浓度为50-200nM。

2.权利要求1的方法，其中所述肾前体细胞表达额外的标记基因WT1和/或SALL1。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤a)的多能培养基是无血清培养基，该无血清培养基补充有Rho-相关的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族蛋白激酶的抑制剂。

4.权利要求3的方法，其中所述Rho-相关的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族蛋白激酶的抑制剂选自1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)。

5.权利要求1或2的方法，其中步骤b)的引发培养基是补充胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。

6.权利要求1或2的方法，其额外包括步骤

d)在适合足细胞增殖的条件下温育步骤c)的产物。

7.权利要求1或2的方法，其中所述诱导的多能干细胞是人细胞。

8.权利要求1或2的方法，其中所述诱导的多能干细胞从患有肾病的受试者获得。

9.权利要求1或2的方法，其还包括产生表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞的生物库。