[发明专利]多能干细胞向多能肾前体分化的方法

说明书

本申请涉及使多能干细胞(PSC)向表达Six2的多能肾前体细胞分化的方法。这些肾前体细胞能够分化成完全功能性的和完全分化的足细胞。此外，本申请涉及基于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤，将人胚胎干细胞(ESC)和经诱导的多能干细胞(iPSCs)分化成表达Six2的确定的肾前体细胞和足细胞的方法。

发明领域

本申请涉及多能干细胞(PSC)向表达Six2的确定的多能肾前体细胞分化的方法。这些肾前体细胞能够分化成完全功能性的和完全分化的足细胞。此外，本申请涉及基于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤，使人胚胎干细胞(ESC)和经诱导的多能干细胞(iPSCs)分化成表达Six2的确定的肾前体细胞和足细胞的方法。

背景

肾细胞用于基础研究、疾病模型、组织工程、药物筛选和体外毒理学。肾具有高度分化和复杂的结构，并且在许多生理过程中具有关键作用，所述生理过程为诸如体液重量摩尔渗透压浓度、流体和电解质平衡的调节、酸碱平衡的调节、代谢废物和外来化学物的排泄，和控制血压的激素的产生和红细胞生成。一旦受损，肾脏很少恢复其功能。肾细胞(例如，足细胞和肾小管细胞)在急性坏死后可以在一定程度上再生。然而，肾脏在具有慢性肾病的患者中一般不再生(Humphreysh Bonventre,2007),导致末期肾功能不全。慢性肾病(CKD)是发病和死亡的主要原因，在西方国家影响11％的成年人口。患有CKD的人遭受生命质量的显著下降。该疾病引起的药物经济负担是非常高的，因为用于移植的供体肾脏存在持久短缺。

哺乳动物肾脏来自间介中胚层(IM)，间介中胚层产生输尿管(ND)，和后肾间充质(MM)。ND产生集尿管系统，其由两个关键细胞类型：主细胞和闰细胞组成。MM限定了帽间充质(CM)并且也产生了间质。CM是肾单位祖先群体并且在肾泡中通过间充质向上皮的转变分化。

肾单位由肾小球簇或血管小球，和肾小管组成。血管小球是高度特化的过滤单位，其为分离废物作为尿排泄。血管小球中血液和尿之间的过滤屏障由高度特化的，称作足细胞的终末分化细胞提供。

会聚的证据提示足细胞的损伤是引发肾功能损失的关键事件之一。足细胞损伤在超高胰岛素血症、血液动力学机制和其他机制之后发生。足细胞的渐进性损失导致肾小球的广泛硬化，伴随着增加的蛋白尿和清除功能的减弱(Wiggins,2007)。

然而，还没有完全理解导致肾脏肾单位中病理生理改变的胰岛素抗药性和再生性质丧失的潜在机理。从而，需要体外细胞模型来研究肾病像CKD的生物学和促进开发新的治疗。

胚胎干(ES)细胞和患者特异性诱导的多能干细胞(iPSCs)是大规模生产肾前体细胞和足细胞的潜在来源，所述细胞用于再生性药物和疾病建模用于药物发现。使用经诱导的多能干细胞(iPSCs)技术(Takahashi,K.Yamanaka,S.,“Induction of pluripotentstem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by definedfactors”,Cell 126,663–676(2006))，可以通过转导四种确定的因子(Sox2,Oct4,Klf4,c-20Myc)，将体细胞再编程为iPSCs。iPSC技术使得能够产生患者特异性iPSCs，其可以分化为患者特异性肾细胞。这些患者特异性肾细胞可用于例如肾病如慢性肾病(CKD)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性增生性肾小球肾炎、多囊性肾病(PKD)和与2型糖尿病相关的糖尿病肾病的病理生理学的体外建模或用于评估药物毒性。尝试这种体外疾病建模的一个重要的前提是实现有效的、稳健的和大小可变的分化系统(Tiscornia等人,2011)。