[发明专利]用于确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的工具和方法

权利要求书

1.用于直接确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽在允许所述神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下孵育一段时间；

b)固定所述细胞并且，任选地，用去垢剂对所述细胞进行可渗透化处理；

c)将所述细胞与特异结合未切割的和神经毒素多肽切割的底物的至少第一捕获抗体并且与特异结合所述神经毒素多肽切割的底物的切割位点的至少第二捕获抗体，在允许所述捕获抗体结合所述底物的条件下相接触；

d)将所述细胞与特异结合所述第一捕获抗体的至少第一检测抗体在允许所述第一检测抗体结合所述第一捕获抗体的条件下相接触，从而形成第一检测复合体，并且与特异结合所述第二捕获抗体的至少第二检测抗体在允许所述第二检测抗体结合所述第二捕获抗体的条件下相接触，从而形成第二检测复合体，其中所述第一检测抗体和所述第二检测抗体携带可检测标记物；

e)确定步骤d)的所述第一和第二检测复合体的量；和

f)通过所述第二检测复合体计算所述细胞中由所述神经毒素多肽切割的底物的量，从而确定所述神经毒素多肽在所述细胞中的生物活性。

2.权利要求1所述的方法，其中所述第一检测抗体和所述第二检测抗体与酶缀合。

3.权利要求2所述的方法，其中所述酶是不同的。

4.权利要求1所述的方法，其中所述方法是荧光方法。

5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述神经毒素多肽是BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/F或TeNT。

6.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述底物是VAMP/小突触泡蛋白、SNAP-25或突触融合蛋白。

7.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞是选自由以下各项组成的组的神经元细胞或神经元分化细胞：原代神经元细胞、能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞或诱导多能干细胞(IPS)衍生的神经元。

8.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中固定所述细胞通过添加选自由以下各项组成的组的固定剂进行：甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或其混合物。

9.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中特异结合所述未切割的和神经毒素多肽切割的底物的所述第一捕获抗体允许确定所述细胞中神经毒素多肽底物的总量。

10.权利要求9中任一项所述的方法，其中特异结合所述未切割的和神经毒素多肽切割的底物的所述第一捕获抗体是来自Sigma的兔多克隆抗-SNAP-25抗体S9684、来自Pierce Antibodies的兔多克隆抗-SNAP25抗体PA5-19708或来自Pierce Antibodies的兔多克隆抗-SNAP25抗体PA5-19701。

11.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二捕获抗体是包含SEQ ID NO:20-22所示的CDRH1，CDRH2和CDRH3和SEQ IDNO:23-25所示的CDRL1，CDRL2和CDRL3的抗体或来自R&D Systems的小鼠单克隆抗体MC-6053。

12.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二捕获抗体被固定。

13.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一检测抗体是碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体、辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体或与荧光染料缀合的抗体。

14.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二检测抗体是碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体、辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体、葡萄糖氧化酶缀合的抗体、酪氨酸酶缀合的抗体或β-半乳糖酐酶缀合的抗体。

15.权利要求13所述的方法，其中HRP底物是Amplex UltraRed、10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(ADHP)或3-(4-羟苯基)丙酸(HPPA)。

16.权利要求13所述的方法，其中AP底物是4-甲基伞形酮磷酸酯衍生物或荧光素二磷酸酯(FDP)。