[发明专利]用于确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的工具和方法

说明书

本发明涉及用于直接确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：a)将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽在允许所述神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下孵育一段时间；b)固定所述细胞，并且，任选地，用去垢剂对所述细胞进行可渗透化处理；c)将所述细胞与特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的至少第一捕获抗体并且与特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的至少第二捕获抗体在允许所述捕获抗体结合所述底物的条件下接触；d)将所述细胞与特异结合所述第一捕获抗体的至少第一检测抗体在允许所述第一检测抗体结合所述第一捕获抗体的条件下接触，从而形成第一检测复合体，并且与特异结合所述第二捕获抗体的至少第二检测抗体在允许所述第二检测抗体结合所述第二捕获抗体的条件下接触，从而形成第二检测复合体；e)确定步骤d)的第一和第二检测复合体的量，和f)通过第二检测复合体计算所述细胞中由所述神经毒素多肽切割的底物的量，从而确定所述神经毒素多肽在所述细胞中的生物活性。本发明还提供用于进行本发明的方法的试剂盒。

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)分别产生高度有效的神经毒素，即肉毒杆菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNT)特异结合神经元细胞并且破坏神经递质释放。每种毒素被合成为无活性的未加工的约150kDa单链蛋白。转录后加工包括二硫桥键的形成，和通过细菌蛋白酶的有限蛋白水解(切割)。活性神经毒素由两条链组成，约50kDa的N末端轻链和约100kDa的重链，它们通过二硫键连接。CNT结构上和功能上由三个结构域构成，即催化轻链，包括易位结构域(N端半)和受体结合结构域(C端半)的重链；参见，例如，Krieglstein 1990，Eur.J.Biochem.188，39；Krieglstein 1991，Eur.J.Biochem.202，41；Krieglstein 1994，J.Protein Chem.13，49。肉毒杆菌神经毒素被合成为分子复合体，其包含150kDa神经毒素蛋白和相关非毒性蛋白。复合体尺寸根据梭菌菌株和不同的神经毒素血清型而不同，范围为从300kDa，大于500kDa，和900kDa。这些复合体中的无毒蛋白稳定神经毒素并且保护其免受降解；参见Silberstein 2004，Pain Practice 4，S19–S26。

肉毒梭菌分泌七种抗原上不同的血清型，其被指定为肉毒杆菌神经毒素(BoNT)A至G。所有血清型连同破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(TeNT)是通过切割SNARE蛋白阻断突触胞吐作用的Zn²⁺-内切蛋白酶；参见Couesnon，2006，Microbiology，152，759。CNT引起肉毒中毒和破伤风中观察到的弛缓性肌肉麻痹；参见Fischer 2007，PNAS 104，10447。

尽管其具有毒性效应，肉毒杆菌毒素复合体已经在大量疾病中被用作治疗剂。1989年肉毒杆菌毒素血清型A在美国被批准用于人类使用，用于治疗斜视、睑痉挛和其他病症。其作为例如商品名为BOTOX(Allergan，Inc.)或商品名为DYSPORT/RELOXIN(Ipsen，Ltd)的肉毒杆菌毒素A(BoNT/A)蛋白制剂是可商购的。商品名为XEOMIN(Merz Pharmaceuticals，LLC)的改善的、无复合体的肉毒杆菌毒素A制剂是可商购的。对于治疗应用，将所述制剂直接注射入要治疗的肌肉中。在生理pH，所述毒素从蛋白复合体释放并且产生所需要的药理效果。肉毒杆菌毒素的效果仅是暂时的，这是为什么可能需要重复施用肉毒杆菌毒素以维持治疗效果的原因。

梭菌神经毒素弱化自主肌肉强度并且是用于斜视，局部肌张力障碍(focal dystonia)，包括宫颈肌张力障碍(cervical dystonia)，和良性自发性睑痉挛(benign essential blepharospasm)的有效疗法。已经进一步证明其减轻偏侧面肌痉挛(hemifacial spasm)，灶性痉挛状态(focal spasticity)，并且此外，在多种适应证中有效，如胃肠病症、多汗症和美容皱纹矫正；参见Jost 2007，Drugs 67，669。