[发明专利]通过顺序杂交编条形码的分子多重标记

说明书

本发明，除其他以外，提供了用于检测和/或定量细胞、组织、器官或生物体中的核酸的技术。在一些实施方案中，本发明通过顺序编条形码提供了用于大量靶的高通量谱分析的方法，所述靶诸如转录物和/或DNA基因座。

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年4月30日提交的美国临时申请序列号61/817,651和2014年3月28日提交的美国临时申请序列号61/971,974的优先权，通过引用各自以其整体并入本文。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

依据由美国国家卫生研究院授予的拨款号R01HD075605，美国政府对此发明具有一定的权利。

技术领域

本申请涉及但不限于通过顺序杂交编条形码的分子多重标记。

发明背景

细胞的转录谱分析(profiling)是许多目的必需的。能够在单细胞中分辨多种mRNA的显微成像可以提供关于转录物丰度和定位的有价值的信息，对理解细胞鉴定的分子基础和开发疾病治疗是重要的。因此，对通过例如显微成像对细胞中转录物的谱分析新的和改进的方法存在需要。

发明概述

本发明提供与对细胞中的，尤其是单细胞中的转录物或DNA基因座谱分析的现有技术相关的挑战或缺点的某些洞见。此外，本发明提供用于有效地实现此类谱分析包括单细胞的此类谱分析的新技术。提供的技术是广泛有用的，包括例如用于分离的细胞、组织中的细胞、器官中的细胞和/或生物体中的细胞的谱分析。

例如，本发明提供以下洞见：现有技术诸如单细胞RNA-seq或qPCR，需要将单细胞分离并且将其放入多孔格式中，这会是成本高昂的、劳动密集的并且倾向产生伪结果(prone to artifacts)的多重步骤的方法。此外，本发明认识到，首先利用酶促反应将mRNA转换成DNA模板的现有原位测序技术可以是非常低效的(例如在mRNA向DNA转化过程中)，因此，通常，只有一小部分的RNA被转化和检测。本发明提供了这样的具体洞见：关于这种低效率(对于RT估计在1％和对于PLA在10％)的一种主要缺点是它可以在基因表达测量中引入显著的噪音和(ad)偏倚。本发明还认识到，利用单分子荧光原位杂交(smFISH)的现有光谱mRNA编条形码技术需要不同的荧光基团用于规模放大，并且可能在可生成的条形码的数量上被限制。smFISH还需要在杂交期间将探针分裂成编条形码的亚组。因为smFISH通常使用两种或更多种颜色用于靶，其在图像中产生高密度的对象，这可增加数据分析的复杂性。

除其他方面，本发明提供了用于对例如转录物和/或DNA基因座谱分析的新技术，该新技术克服了与本发明之前的方法有关的问题的一种或更多种或所有。在一些实施方案中，本发明提供用于通过允许不同靶的多路复用的顺序条形码方案在细胞中检测多个靶(例如转录物或DNA基因座)的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了方法，所述方法包括以下步骤：

(a)进行第一接触步骤，所述第一接触步骤包括使包含多种(a plurality of)核酸的细胞与第一多种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸的每一种靶向核酸并且被可检测部分标记，因此组合物至少包含：

(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸靶向第一核酸并且被第一可检测部分标记；和

(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸靶向第二核酸并且被第二可检测部分标记；

(b)在第一接触步骤之后对细胞成像，以便检测所述第一多种的寡核苷酸与其靶的相互作用；

(c)进行第二接触步骤，所述第二接触步骤包括使所述细胞与第二多种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第二多种包括靶向被所述第一多种靶向的重叠核酸的寡核苷酸，因此所述第二多种至少包含：