[发明专利]融合聚合酶

说明书

提供了含有与天然不具有5’‑3’外切核酸酶活性的聚合酶相连的异源性5’‑3’外切核酸酶结构域的融合多肽，及其使用方法。还公开了其他方面。

相关专利申请的交叉参考

本申请要求2013年12月6日提交的美国临时专利申请号61/912,981以及2014年6月2日提交的美国临时专利申请号62/006,409的优先权，上述文献都通过引用纳入本文以用于所有目的。

背景技术

核酸扩增反应(如聚合酶链式反应(PCR))通常是模板依赖的反应，其中通过使用过量的两种寡核苷酸引物处理靶核酸的单独的互补链来扩增所需核酸序列。延伸引物以形成互补引物延伸产物，其作为合成所需核酸序列的模板。在这类过程中，各DNA链上的引物之间的核酸序列被选择性扩增。

已发现多种热稳定性聚合酶可用于PCR。已知至少5个DNA-依赖DNA聚合酶家族，虽然大多数落入A、B和C家族。各家族之间很少或没有结构或序列相似性。大多数A家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3'到5'外切核酸酶活性和5'到3'外切核酸酶活性)的单链蛋白质。B家族聚合物通常有具有聚合酶和3'到5'外切核酸酶活性的单个催化结构域，以及辅助因子。C家族聚合酶通常是具有聚合和3'到5'外切核酸酶活性的多亚基蛋白质。

Taq聚合酶具有固有的聚合酶和5’-3’外切核酸酶活性，但不具有3’-5’外切核酸酶(“校对”)活性。利用Taq的固有5’至3’外切核酸酶活性，可以实现PCR扩增并从靶标特异性发荧光探针(如“Taqman”探针)中释放信号。Taq的5’至3’外切核酸酶活性切割杂交的寡聚体探针的5’端以释放单核苷酸和寡核苷酸。该探针在链复制期间水解，使得累积的荧光信号与扩增相关联。

与Taq DNA聚合酶相比，Pfu DNA聚合酶和其他B家族聚合酶具有优异的热稳定性、抑制剂耐受性和校对性质。不同于Taq DNA聚合酶，Pfu DNA聚合酶具有3’至5’外切核酸酶校对活性，意味着其沿DNA从5’端至3’端工作并校正核苷酸错误掺入的错误。这表示，与Taq生成的PCR插入物相比，Pfu DNA聚合酶生成的PCR片段将具有较少的错误。然而，Pfu和其他B家族聚合酶缺少5’-3’外切核酸酶活性且因此无法在基于探针的定量PCR方法(如涉及Taqman探针的方法)中起作用。

发明内容

本发明提供了具有至少聚合酶活性和5’-3’外切核酸酶活性的多肽，这些多肽(“融合多肽”)包含与异源性聚合酶相连的5’-3’外切核酸酶结构域，所述异源性聚合酶天然不具有5’-3’外切核酸酶活性。在一些实施方式中，该聚合酶活性和5’-3’外切核酸酶活性是热稳定的。

在一些实施方式中，该异源性聚合酶是B家族聚合酶。在一些实施方式中，该异源性聚合酶衍生自两种亲本聚合酶。

在一些实施方式中，该5’-3’外切核酸酶结构域是侧翼内切核酸酶5’-3’外切核酸酶结构域。在一些实施方式中，该5’-3’外切核酸酶结构域是来自聚合酶的5’-3’外切核酸酶结构域。

在一些实施方式中，该聚合酶包含尿嘧啶敏感结构域(USD)。在一些实施方式中，该USD包含基本消除尿嘧啶敏感活性的一个或多个点突变。

在一些实施方式中，该聚合酶缺少天然尿嘧啶敏感结构域(USD)的至少10个(例如至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或125个)氨基酸。在一些实施方式中，该尿嘧啶敏感结构域(USD)被移除或不存在。

在一些实施方式中，该融合多肽还包含异源性序列非特异性双链或单链DNA结合结构域。在一些实施方式中，该异源性序列非特异性双链DNA结合结构域包含Sso7DNA结合结构域或Sso7样DNA结合结构域。在一些实施方式中，该异源性序列非特异性双链DNA结合结构域与SEQ ID NO:27、28、29、30或31中任一种基本(例如至少60％)相同。