[发明专利]用于在基于乳液的微流体中测序的系统和方法

权利要求书

1.一种确定靶核酸中核苷酸序列的方法，所述方法依赖于不同引物序列与靶核酸的杂交或缺少杂交，所述方法包括，

划分包含靶核酸的多个拷贝的混合物，从而生成多个靶划分产物，所述靶划分产物是液滴；

以多个引物划分产物提供一系列被设计成与靶核酸杂交的引物，至少大部分所述引物划分产物包含两种或更多种不同的引物，所述两种或更多种不同的引物具有至少4个指定核苷酸，所述引物挑选为依据核酸序列中存在的变体与靶核酸序列杂交，其中，各引物出现在多个不同引物划分产物中，并且，任两个引物组的交集都不含超过一种共同的引物，各引物组含有已知数目和特征的引物，所述一系列被设计成与靶核酸杂交的引物包含指定核苷酸的引物序列的可能组合的至少40%；

以一比一合并(i)所述靶划分产物的至少一部分和(ii)引物划分产物以形成多个反应划分产物；

在完全互补的引物与所述靶核酸序列杂交且不完全互补的引物不与所述靶核酸杂交的条件下在所述反应划分产物中使所述靶核酸与所述引物杂交；

确定所述系列中的何种引物与所述靶核酸杂交，当且仅当划分产物中含有的所有引物都不杂交时，划分产物生成试验阴性应答；所述靶核酸包含荧光部分且退火至包含淬灭剂的淬灭寡核苷酸，所述淬灭剂退火至所述靶核酸淬灭所述荧光部分的荧光；所述确定包括使退火至淬灭剂寡核苷酸的所述靶核酸接触引物依赖性聚合酶，如果杂交，所述引物的延伸导致所述淬灭剂寡核苷酸被置换，从而生成荧光信号；所述确定还包括检测是否存在所述荧光信号，存在所述荧光信号表示所述多种引物之一与所述靶核酸杂交，且缺少所述荧光信号表示所述多种引物无一与所述靶核酸杂交；以及

基于何种引物与所述靶核酸杂交以及何种引物与所述靶核酸不杂交来确定靶核酸中的核苷酸序列；

所述引物划分产物含有一种或多种与划分产物中具体引物一致性关联的分光光度物质，由此可通过检测所述划分产物的分光光度特征来确定所述划分产物中引物的序列，且所述确定还包括检测分光光度特征并将所述分光光度特征与所述引物的序列关联。

2.如权利要求1所述的方法，所述一系列引物包含指定核苷酸数目不同的至少2种引物，指定核苷酸多于4个核苷酸。

3.如权利要求1所述的方法，所述一系列引物包含指定核苷酸数目不同的至少3种引物，指定核苷酸多于4个核苷酸。

4.如权利要求1所述的方法，所述一系列引物包含指定核苷酸数目不同的至少4种引物，指定核苷酸多于4个核苷酸。

5.如权利要求1所述的方法，其中，生成至少100份部分所述靶划分产物；且所述合并包括将这100份部分靶划分产物各自分别与不同的引物划分产物合并。

6.如权利要求1所述的方法，所述靶核酸是扩增子。

7.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括基于所述荧光信号的存在或不存在和所述引物序列反卷积所述靶核酸的核苷酸序列。

8.如权利要求1所述的方法，所述一系列引物包含n组引物，不同的划分产物含有不同的引物组，不同的引物组具有2-20种不同的独特引物，且不同的引物划分产物之间具有不超过一种共有引物，其中，n是1000-300000。

9.如权利要求8所述的方法，其中，n组中每一组的划分产物各含有一种或多种分光光度物质，由此使得n组中的每一组都可通过分光光度特征区分。

10.如权利要求8所述的方法，所述组中的至少大部分引物出现在两个不同的引物组中。

11.如权利要求1所述的方法，其中，一个引物划分产物中任两种引物的序列没有超过两个核苷酸的重叠。

12.如权利要求1所述的方法，所述系列中的一些引物具有6-18个指定核苷酸。

13.如权利要求1或12所述的方法，所述指定核苷酸是连续的。