[发明专利]用于在基于乳液的微流体中测序的系统和方法

说明书

提供了用于核苷酸测序的方法、文库和试剂盒。

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年5月29日提交的美国临时专利申请号61/828,582的优先权，该文通过引用纳入本文。

背景技术

DNA测序是确定DNA分子中核苷酸的精确顺序的过程，例如DNA链中四种碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的顺序。快速DNA测序方法的出现极大地加速了生物和药学研究和发现。

DNA序列的知识已用于基础生物学研究和多种应用领域，例如诊断、生物技术、法医生物学和生物系统学。使用现代DNA测序技术获得快速测序已被用于完整DNA序列或多种类型和物种的基因组(包括人基因组和许多动物、植物和微生物物种的其他完整DNA序列)的测序。

发明内容

本发明提供了确定靶核酸中核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，该方法包括，划分包含多个靶核酸拷贝的混合物，从而生成多个靶划分产物；在多个引物划分产物中提供一系列引物，至少大部分引物划分产物包含两种或更多种引物，所述引物具有至少4个指定核苷酸，这些引物的其他核苷酸位置(如果有)是简并位置或通用核苷酸；以一比一的基础合并(i)至少一部分靶划分产物和(ii)引物划分产物以形成多个反应划分产物；在完全互补的引物与靶核酸杂交且不完全互补的引物不与靶核酸杂交的条件下在反应划分产物中使靶核酸杂交引物；确定该系列中哪些引物结合靶核酸；以及基于结合靶核酸的引物确定靶核酸中的核苷酸顺序。

在一些实施方式中，该系列的引物包含指定核苷酸数目不同的至少2、3或4种引物，指定核苷酸多于4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，例如一些引物具有一种数目(如X>4)的指定核苷酸且该系列中的其他引物具有不同数目(如Y>4)。

在一些实施方式中，生成至少100、500、1000或10000份部分的靶划分产物；且所述合并包括将100、500、1000或10000份部分中的每一个与不同的引物划分产物合并。

在一些实施方式中，该靶核酸是扩增子。

在一些实施方式中，该靶核酸包含荧光部分且退火至包含淬灭剂的淬灭寡核苷酸，其中，淬灭剂退火至靶核酸淬灭荧光部分的荧光。在一些实施方式中，所述确定包括使退火至淬灭剂寡核苷酸的靶核酸接触引物依赖性聚合酶，如果杂交，该引物的延伸导致淬灭剂寡核苷酸的置换，从而生成荧光信号。在一些实施方式中，分成的各份引物包含具有不同序列的多种引物，且所述确定包括：检测是否存在荧光信号，存在荧光信号表示多种引物之一杂交至靶核酸而缺少荧光信号表示多种引物无一杂交至靶核酸；且该方法还包括基于是否存在荧光信号和引物序列反卷积(deconvolute)靶核酸的核苷酸序列。

在一些实施方式中，这些引物划分产物含有一种或多种与划分产物中具体引物具有一致性关联的分光光度物质，从而可通过检测划分产物的分光光度特征确定划分产物中引物的序列，且所述确定还包括检测分光光度特征并将分光光度特征与引物序列关联。

在一些实施方式中，该系列引物包含n组引物，具有含有不同组引物的不同划分产物，不同的引物组具有2-20种不同的独特引物且不同的引物划分产物之间具有不超过一种共有引物，其中n是1000-300000。在一些实施方式中，n组中每一组的划分产物含有一种或多种分光光度物质，使得n组中的每一组都可通过分光光度特征区分。在一些实施方式中，该组中的至少大部分引物出现在两个不同的引物组中。

在一些实施方式中，引物划分产物中任两种引物的序列没有超过两个核苷酸的重叠。

在一些实施方式中，这些系列中的一些引物具有6-18个(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个)指定核苷酸。

在一些实施方式中，这些指定核苷酸是连续的。在一些实施方式中，这些指定核苷酸至少一些是不连续的，使得指定核苷酸中至少两个被至少一个简并核苷酸位置或通用核苷酸隔开。