[发明专利]用于在原核细胞中重组生产多肽的方法

说明书

技术领域

本发明公开通过敲除NADH脱氢酶II基因(ndh-基因)而遗传修饰的原核细胞和其在生产多肽中的用途。

背景技术

近年来蛋白质生产稳步增长，在不久的将来蛋白质可能成为可用于治疗各种疾病的疗法中的最大组。蛋白质的影响来自于其特异性，如其特异的靶标识别和结合功能。

在发酵方法中使用细胞培养物生产物质，特别是生产蛋白质。有两种不同的方法，其一是细胞培养物未被遗传修饰而形成其自身代谢产物的方法，另一是生物体被遗传修饰从而或者生产更为大量的自身物质如蛋白质或者生产外源(异源)物质。为产生物质的生物体提供营养培养基，其保证了生物体的存活并使其能生产所需的目标化合物。众多用于这些目的培养基是公知的，其允许特定宿主的最佳培养。

Riesenberg(Riesenberg,D.,等人,Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)380-384)和Horn(Horn,U.,等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.46(1996)524-532)报道了大肠杆菌的高细胞密度培养。Riesenberg,D.和Guthke,R.(Appl.Microbiol.Biotechnol.51(1999)422-430)报道了微生物的高细胞密度培养。Shiloach,J.和Fass,R.(Biotechnol.Advances23(2005)345-357)对培养大肠杆菌到高细胞密度进行了综述。

Calhoun等人(J.Bacteriol.175(1993)3020-3025)报道了大肠杆菌的能效——在需氧呼吸链组分中突变的影响。Melo等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.68(2004)603-616)报道了对II型NAD(P)H：醌氧化还原酶的新见解。Yun等人(J.Appl.Microbiol.99(2005)1404-1412)报道了在NADH脱氢酶缺陷大肠杆菌的adhE或pta-ackA突变体中乳酸和琥珀酸形成的增强。

Trinh等人(Met.Eng.8(2006)628)报道了最高效的生物质生产大肠杆菌细菌的设计、构建和性能。

发明内容

已发现，通过缺失/失活编码酶NADH脱氢酶Ⅱ的ndh-基因，可获得遗传修饰的原核生物，相对于除ndh-基因外同基因的亲代菌株，其具有相当的摄氧率、相当的生长率、但增加的生产力(productivity)。因此，已发现，通过ndh-基因的缺失/失活，可以增加原核生物的比生产力。

如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：

-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和

-从细胞或培养基中回收多肽，

其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)。

如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：

-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和

-从细胞或培养基中回收多肽，

其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，

和其中所述多肽不是酶。

如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：

-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和

-从细胞或培养基中回收多肽，

其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，

且其中所述多肽不是呼吸链途径酶或由抗生素抗性诱导基因编码的多肽。

如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：

-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和

-从细胞或培养基中回收多肽，

其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，

和其中所述多肽不是NADH脱氢酶、SoxM型氧化酶、Sox型氧化酶、细胞色素bd型氧化酶、细胞色素bo型氧化酶或由抗生素抗性诱导基因编码的任何多肽。

如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：

-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和

-从细胞或培养基中回收多肽，