[发明专利]在无细胞生物合成系统中对代谢通量的控制

说明书

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年6月5日提交的美国临时专 利申请U.S.S.N.61/831,376的优先权，其通过提述并入本文。

发明领域

通过合成酶促途径在微生物宿主中生产化学品已经证明对许多重要种 类的分子有用，包括类异戊二烯，聚酮化合物，非核糖体肽，生物塑料和化 学构建模块。由于生物信息的内在模块性，合成生物学拥有巨大的潜力将这 一微生物生产的化合物列表进一步扩展。然而在宿主细胞的代谢网络中植入 新的生物化学途径可能破坏细胞已经进化了几千年的精妙的调节机制。的 确，化合物的最终产出通常被对工程化的细胞的代谢的有害影响限制，由于 对细胞中发生的复杂的相互作用的理解有限，难以预测所述有害影响。对细 胞资源不受调节的消耗，异源蛋白生产的代谢负担，以及对宿主细胞抑制性 或毒性的途径中间物/产物的积累都是可能限制总体产出的显著问题。

已出现了代谢工程的概念来实现这一目的，其可以定义为对代谢和细胞 网络有目的的修饰，通过采用多种实验技术来达到所需的目标。将代谢工程 从遗传工程和菌株改良区分的是，它将代谢和其它细胞网络作为整体考虑来 鉴定待工程化的靶标。在这个意义上，代谢通量是代谢工程的实施中的一个 基本概念。虽然细胞中的基因表达水平和蛋白以及代谢物的浓度可以提供代 谢网络状态的线索，由于缺乏这些细胞组分之间相关性的信息，它们在充分 描述细胞表型中具有内在的限制。代谢通量代表了代谢途径中的反应速率， 并用来通过数学框架整合这些因素。因此，可以将代谢通量考虑为一种代表 作为多种细胞组分之间相互作用的结果的细胞表型的方式；观察到的代谢通 量概貌反应了相互联系的转录，翻译，以及合并复杂调节的酶反应的结果。

无细胞合成可以提供胜过体内生产方法的优势。无细胞系统可以指导细 胞的大多数(如果不是全部)代谢资源朝向一个途径的独占产物。此外，体 外细胞壁的缺失是有利的，因为它允许对合成环境的控制。

由于大多数生物体的环境不断变化，代谢反应被精细的调节以维持细胞 内的稳态条件。通过调节途径内酶的活性控制代谢途径，通过改变所述蛋白 的活性，例如，通过变构抑制等等；以及通过改变所述酶的表达或翻译以及 其稳定性；即，其有效寿命。也通过改变细胞中存在的底物或辅因子的浓度 调节途径。

影响通过途径的通量的分子有辅酶，包括ATP。该核苷酸用于在不同的 化学反应之间转移化学能，并在磷酸化反应中作为磷酸基团的载体。烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸(NADH)，一种维生素B3(烟酸)的衍生物，是一种作为 电子载体的重要辅酶。其以两种相关的形式存在于细胞中，NADH和 NADPH。多种单独类型的脱氢酶从它们的底物移除电子并将NAD+还原为 NADH。然后该辅酶的这一还原形式是细胞中需要还原它们的底物的任意还 原酶的底物。

多种酶促反应是氧化还原反应，其中一种化合物被氧化而另一种化合物 被还原。生物体进行氧化还原反应的能力依赖于环境的氧化还原(redox) 状态，或其还原电位。虽然有些时候通过单个度量表示，更有用的分析将检 查重要的氧化还原剂的氧化还原状态，特别是NAD+和NADP+辅酶。接着 具体的氧化还原(或者电子转移)酶的存在和活性将决定不同氧化还原剂的 相对氧化还原状态。例如，酶谷胱甘肽还原酶催化电子从NADPH转移至氧 化谷胱甘肽以形成还原的谷胱甘肽和NADP+。取决于反应的速率和其它因 素，NADPH/NAD+对的氧化还原状态可以与氧化的/还原的谷胱甘肽对的氧 化还原状态近似相同或不相等。虽然活细胞已经形成了许多策略以紧密的调 节不同的这些氧化还原对的细胞内氧化还原状态，通过调节途径和氧化还原 缓冲物，例如，谷胱甘肽和/或抗坏血酸盐，无细胞系统可能要求工程化来 提供这些调节并对于这些工程化和控制特别适合。

为了优化影响系统性能的条件，期望操纵在无细胞生物合成反应期间影 响关键代谢物和途径的代谢通量率的参数，这些参数可能反应了通过不同途 径的碳源(例如葡萄糖)利用之间的平衡，并且也可以相对NADH和NADPH 产生优化ATP产生。本发明解决了这一问题。

发明概述