[发明专利]通过生长测量的质谱法抗药性测定

说明书

本发明涉及一种测定微生物对抗生素的抗药性的质谱方法，其中在含有抗生素的基体中培养微生物，在培养微生物之后采集微生物质谱。本方法的特点是，通过按剂量添加并且在质谱中共测的参考物质来通过质谱测定在培养期间出现的任何微生物生长，其中微生物生长表明对抗生素有抗药性。

技术领域

本发明涉及一种使用质谱法测定微生物对抗生素的抗药性的方法。

定义

本文使用单位“道尔顿”(Da)，而非规定的“统一的原子质量单位”(u)，Da单位添加于“国际计量局”的“国际单位制(SI)”文件的上一版(第八版，2006年)中，与统一的原子质量单位处于同等地位；如已注意到的，这主要是为了能够使用单位千道尔顿、毫道尔顿和类似单位。

虽然在优选为3,000至15,000道尔顿的质量范围内，一般将蛋白质称为“多肽”更为确切，但为了简单起见，本文只使用“蛋白质”一词。从较轻的多肽到较重的蛋白质的转变并不固定，没有明确的定义。

术语“微生物(microbes)”在本文中通常用作“微生物(microorganisms)”的简称。一般而言，单数形式的微生物(microbe)还表示微生物物种以及单个微生物细胞。复数形式的微生物(microbes)表示待分析的多个微生物细胞。

背景技术

目前，可通过质谱法在误差率较低的情况下快速鉴定多种微生物，特别是细菌和单细胞真菌(例如酵母)。鉴定方法一般是计算破碎(裂解)微生物(特别是其可溶性蛋白)的质谱与已知微生物的相似类型的参考质谱之间的相似度值。如果相似度值超过特定极限值，则可鉴定科、属、种甚至株系。在许多大规模研究中以及在微生物实验室的日常工作中，这种速度很快、成本低廉的微生物鉴定方法经证明非常成功。根据仪器，同时可以鉴定48至384个微生物样本；从菌落培养结束到鉴定只需几分钟即可完成。该方法的错误率非常低，远低于传统微生物鉴定方法的错误率，甚至低于DNA分析的错误率。市面上有的质谱仪、相关评估程序和参考谱库已被认证为可用于医疗诊断的IVD产品，符合德国医疗设备法(MPG)及其他国家或国际法规和准则。

通常按照一般说法，术语“抗生素”是指用于治疗微生物感染性疾病的药理学活性物质，也指消毒物质。青霉素的成功导致寻找和发现了许多其他抗生素。广谱抗生素对许多微生物科均起效，而窄谱抗生素特异性地对单一微生物种起效。

自从首次使用青霉素作为药理学活性物质以来，微生物株系对各种抗生素逐渐产生各种抗药性，或从其他微生物获得抗药性，即获得使得它们能够削弱抗生素物质的效果、或使其彻底失效的特性。而遗憾的是，抗药性非常普遍，现在医院中的微生物大多具有抗药性。某些情况下，可以预测在医院内传播的微生物对医院常用抗生素的抗药性，但这并不适用于在医院外发生的感染。

成功治疗微生物感染(如脓毒血症等急性情况、或已有原发疾病(或原发感染)期间的二次感染通常威胁生命)一般取决于抗生素首次用药是有效的。针对性用药不仅要求尽可能快速、正确地鉴定病原体，而且要求尽快确定其对不同抗生素的抗药性。测定抗药性的常规方法包括在有抗生素的条件下进行培养，但遗憾的是，这需要很长时间：24至48小时。

除了在有抗生素的条件下培养之外，还可采用遗传学方法测定抗药性。在此方法中，通过检测待测病原体的基因组中的已知抗药性基因来检测抗药性。遗传学方法的优点在于，可通过例如聚合酶链式反应(PCR)等技术扩增抗药性基因，因此分析所需时间不再由细菌生长速率来决定。缺点是此方法比常规方法更加昂贵，而且不是功能测试。抗药性基因可能存在，但不表达，这意味着待研究的细菌株系没有抗药性，但遗传学方法将其检测为有抗药性。

专利DE 10 2006 021 493 B4(V.M.Govorun和J.Franzen，2006年，对应于GB 2438 066 B和US 8,293,496 B2；下称“Govorun”)公布了用质谱法测定微生物抗药性的方法。