[发明专利]用于筛选对复制禽病毒受纳的细胞系的方法

权利要求书

1.一种用于获得允许禽病毒体外复制的非转化的禽细胞系的方法，其至少包括以下步骤：

a)存在基质时，培养禽胚胎干细胞至少三天；

b)在低血清浓度介质中培养至少两天；

c)在含1至10mM的六亚甲基二乙酰胺的低血清浓度介质中培养至少2天；

d)在低血清浓度介质中培养至少10天；

e)培养或冷冻允许禽病毒的复制的禽细胞系；

其中，低血清浓度介质是指含有低于5％的血清的介质；

其中，所述基质是指衍生自细胞的细胞外基质复合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其至少包括以下步骤：

a)存在基质时，培养禽胚胎干细胞4天；

b)在低血清浓度介质中培养细胞3天；

c)在含10％血清的介质中培养细胞10天；

d)在含1至10mM的六亚甲基二乙酰胺的低血清浓度介质中培养细胞3天；

e)在低血清浓度介质中培养细胞15天；

f)培养或冷冻允许禽病毒的复制的禽细胞系；

其中，低血清浓度介质是指含有低于5％的血清的介质；

其中，所述基质是指衍生自细胞的细胞外基质复合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其至少包括以下步骤：

a)存在基质时，培养禽胚胎干细胞4天；

b)在低血清浓度介质中培养细胞3天；

c)在含10％血清的介质中培养细胞10天，并通过胰蛋白酶消化传代；

d)在含1至10mM的六亚甲基二乙酰胺的低血清浓度介质中培养细胞3天；

e)通过胰蛋白酶消化将细胞在含10％血清的介质中传代3天；

f)在低血清浓度介质中培养细胞15天；

g)通过胰蛋白酶消化将细胞在含10％血清的介质中传代12天；

h)培养或冷冻禽细胞系，所述的细胞系在合适的培养介质中在至少60代具有稳定的表型，且允许禽病毒的复制；

其中，低血清浓度介质是指含有低于5％的血清的介质；

其中，所述基质是指衍生自细胞的细胞外基质复合物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当步骤a)至e)以这种顺序实施时，所述方法至少包括以下步骤：

a)存在基质时，培养禽胚胎干细胞至少3天；

b)在低血清浓度介质中培养来自步骤A)的细胞至少2天；

c)在含1至10mM的六亚甲基二乙酰胺的低血清浓度介质中培养来自步骤B)的细胞至少两天；

d)在低血清浓度介质中培养来自步骤C)的细胞至少10天；

e)培养来自步骤D)的细胞，或冷冻允许禽病毒的复制的禽细胞系；

其中，低血清浓度介质是指含有低于5％的血清的介质；

其中，所述基质是指衍生自细胞的细胞外基质复合物。

5.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其特征在于，所述的禽病毒是马立克氏病毒或双RNA病毒。

6.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其特征在于，所述的禽胚胎干细胞来自鸡。

7.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其特征在于，所述的禽胚胎干细胞分离自在X期至XIV期的胚盘。

8.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其特征在于，在步骤b)、c)和d)后，所述的方法进一步包括用于在合适的生长介质中培养细胞的步骤。

9.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其特征在于，所获得的禽细胞系在合适的培养介质中至少60次传代中具有稳定的表型。

10.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其特征在于，所获得的禽细胞系经基因修饰以表达感兴趣的蛋白。

11.一种细胞系，其可通过权利要求1至10中的任一项所述的方法获得，所述的细胞系表达以下标志物：CD44+、整合素β1、胶原蛋白1和OLFM3。