[发明专利]用于筛选对复制禽病毒受纳的细胞系的方法

说明书

本发明涉及一种用于获得未转化的禽细胞系的方法，所述的禽细胞系能够在体外使禽病毒复制。所述的方法包括以下步骤：a)存在基质时，将禽胚胎干细胞培养至少三天；b)在含低血清浓度的介质中培养至少两天；c)在含1至10mM的六亚甲基二乙酰胺(HMBA)的低血清浓度的介质中培养至少2天；d)在低血清浓度的介质中培养至少10天；以及e)培养或冷冻能够使禽病毒复制的禽细胞系。本发明还涉及所得到的细胞系以及其在疫苗制剂中的用途。

技术领域

本发明涉及一种用于从禽胚胎干细胞筛选对复制禽病毒受纳的细胞系的方法。

背景技术

引言

家禽农场受几种病毒疾病的影响或威胁，其影响可是直接的(病毒诱导的病理)或者间接的(为其他病毒、细菌或寄生虫感染打下基础的免疫抑制)。

接种疫苗广泛应用于主要的每年供应的禽类(鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹑、鹅、鸭……)，然而造成了两个难题：

·疫苗的生产成本必须与农业保持匹配，对农民仅产生低的利润空间。尽管在接种疫苗的个体方面市场是相当大的(例如，在法国2011年4.4千万产蛋母鸡)，然而疫苗仅能以超过几欧分/剂量的价格销售。

·必须确保生物安全，特别是在减毒活疫苗的使用中潜在的病原菌污染的载体。应召回接种了疫苗的饲养动物，并且在筛选金字塔(pyramide de sélection)的顶部的意外污染，对整个生产链具有巨大的影响。

在许多病毒起源的病理中，马立克氏病(Marek’s Disease-MD)是一种影响鸡的T细胞的感染性淋巴组织增生疾病。MD的临床表现主要影响母鸡(原鸡(Gallus gallus))，但是其它来自鸡形目(Galliformes)的鸟类同样可被感染并显现症状(鹌鹑或火鸡)。在60年代，这种疾病作为对世界家禽养殖的主要限制逐渐出现。马立克氏病被认为是产蛋母鸡的第二感染性疾病，据估算有10亿美元/年的总体影响，这些损失与病理和接种疫苗的成本有关(FAO数据，2002)。

马立克氏病是由一种疱疹病毒所导致，所述的疱疹病毒是马立克氏病毒属的α-疱疹病毒科的亚家族，被称为马立克氏病病毒(le virus de la maladie de marek，MDV)或禽疱疹病毒2型(Gallid herpesvirus type 2，GaHV-2)。马立克氏病毒属包括其他四种禽病毒：禽疱疹病毒3型(GaHV-3)、更为特异地影响火鸡的吐绶鸡疱疹病毒(Meleagridherpesvirus，MeHV-HVT代表火鸡疱疹病毒)、特别地影响鸽形目(Columbiformes)的鸽疱疹病毒1型(Colombid herpesvirus 1，CoHV-1)、以及特别地影响鸭科(anatidae)(鸭、鹅)的鸭疱疹病毒1型(Anatid herpesvirus1，AHV-1)。

MDV通过健康的动物与感染的鸡的直接接触，或者通过暴露于来自感染的动物的皮屑碎片所污染的处所、落物、灰尘，在家禽农场中迅速传播。在呼吸道发生病毒的进入，其中肺B淋巴细胞在疾病的进展中发挥重要的作用。

在20世纪90年代出现与高致病性病毒的出现相关的这种疾病极其急性的形式。

自70年代以来，疫苗提供了在家禽农场中控制马立克氏病的可能性。仅活疫苗有效，并且存在两种类型的疫苗，它们通过减毒GaHV-2(同源的)或者衍生自天然的致病性(apathogènes)株MeHV-1或GaHV-3(异源的)所获得。衍生自MeHV-1的疫苗制剂卵内施用于17–18日龄的胚胎，且同源的疫苗注射至在孵化中的小鸡。GaHV-2病毒的感染度与活的受感染细胞相关：在上清液中和细胞裂解液中，检测不到的游离的病毒颗粒(Churchill，1968)。因而，GaHV-2感染的传播需要在体外使感染的细胞与初始细胞共培养，或者在体内通过注射至动物施用活的感染的细胞。因此，目前的GaHV-2疫苗由培养或冷冻细胞中感染的细胞组成。

现有技术