[发明专利]减毒流感疫苗和其用途

说明书

本文中提供了减毒流感病毒和制造减毒流感病毒的方法。

本申请要求2013年7月19日提交的美国临时申请号61/856,442的权益，该美国临时申请的公开内容是以全文引用的方式并入本文中。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在政府资助下根据国家卫生研究院(NIH)授权号HHSN2662007000008C、NIH授权号T32 GM068411和NIH授权号T32 GM07356来进行。政府享有本发明的某些权利。

背景

流感是以轻度至重度疾病为标志且在一些情况下甚至以死亡为标志的严重公共卫生问题。目前的活减毒流感疫苗(LAIV)的减毒程度不足以施用于2岁以下的儿童、孕妇、免疫性受损人士或处在流感并发症的高风险之下的人士。然而，这些人群处在流感并发症的高风险之下。

发明概要

本文中提供了一种经修饰的甲型流感病毒，其包含在氨基酸310至325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶。还提供了一种编码甲型流感病毒的PB1聚合酶的重组核酸，其中所述核酸编码在氨基酸310至325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶。还提供了包含本文中所描述的任何甲型流感病毒或包含本文中所描述的任何编码PB1聚合酶的核酸的细胞群体。聚合酶突变产生温度敏感性病毒，其中所述病毒具有从约37℃至约39℃(即，在体温下)减缓的生长。这种减缓的生长潜力在用于诱导免疫反应时有利于提高病毒的安全性。

还提供了一种用于在受试者中引发针对流感病毒的免疫反应的方法，其包括施用有效剂量的本文中所描述的经修饰的甲型流感病毒和药学上可接受的载体。

还提供了一种用于在受试者中治疗或预防流感感染的方法，其包括向已受流感感染或易受流感感染的受试者施用有效剂量的如本文中所描述的经修饰的甲型流感病毒和药学上可接受的载体。

还提供了一种产生本文中所描述的甲型流感病毒的方法，其包括(a)用一个或多个包含以下各项的载体转染宿主细胞群体：i)编码甲型流感病毒的内部基因组节段的核酸序列；和ii)编码在氨基酸310至325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶的核酸；(b)培养所述宿主细胞；和(c)回收经修饰的甲型流感病毒。

还提供了一种用于产生流感免疫原的方法，其包括：(a)用本文中所描述的任何甲型流感病毒感染细胞群体；(b)培养所述细胞；(c)从步骤(b)的培养物中收集所述病毒；和(d)用所收集的病毒制备免疫原。

附图描述

图1示出了对在37℃下具有温度敏感性的PB2单基因置换病毒的鉴定。用单基因置换病毒以0.01的感染复数(MOI)将MDCK细胞感染1h，其中PB2来自于冷传代A/AnnArbor/6/60，并且所有其他基因都来自于季节性病毒株A/Korea/82。用含镁和钙的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(Invitrogen)将细胞洗涤一次，然后在34℃、37℃或39℃下在含有0.15％牛血清白蛋白(BSA)和1μg/ml甲苯磺酰基磺酰基苯基丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)-胰蛋白酶的DMEM中培养。在所指示的时间点，收集并置换10％培养物上清液，并且通过TCID-50测量来测定病毒效价。

图2示出了PB1319Q突变显著降低人类甲型流感病毒RNA聚合酶在37℃下的功能活性。在人类HEK-293FT细胞中通过定量在经PB1、PB2、PA和NP蛋白表达质粒以及表达流感病毒样RNA构建体的报告质粒转染的细胞的澄清细胞溶解产物中对萤火虫荧光素酶的荧光素酶活性来表征所指示的聚合酶的聚合酶活性。在所指示的温度下孵育细胞。所有测定都利用相同的NP质粒。描绘了萤火虫发光与海肾发光之比。数据是最少三个独立实验的平均值。误差线表示一个平均标准误差。这一小基因组测定中所使用的所有质粒都相同，但在残基319处编码Q的PB1质粒(如所指示)除外。这些质粒是通过将共有序列从病毒生长曲线克隆到哺乳动物pCAGGS表达载体中而由病毒母液产生。