[发明专利]羊膜间充质系细胞组合物的制造方法和冷冻保存方法、以及治疗剂

说明书

本发明的目的在于提供间充质系细胞组合物的制造方法，该方法仅通过一次酶处理，就能简便且无菌地分离高纯度的羊膜来源的MSC。本发明能够提供包括将羊膜用胶原蛋白酶与嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶进行酶处理的工序、以及将酶处理后的羊膜进行过筛的工序的间充质系细胞组合物的制造方法；经过冷冻保存的间充质系细胞组合物的制造方法；以及以上述间充质系细胞组合物为有效成分的移植物抗宿主病·炎性肠病·系统性红斑狼疮·肝硬化·放射性小肠炎治疗剂。

技术领域

本发明涉及高纯度且简便地从羊膜分离适于细胞治疗应用的间充质系细胞(Mesenchymal stromal cell：MSC)，从而制造间充质系细胞组合物的方法。本发明还涉及经过冷冻保存的间充质系细胞组合物的制造方法、以及包含间充质系细胞组合物的治疗剂。

背景技术

间充质系干细胞被认为是存在于骨髓的成体干细胞，作为干细胞，具有分化成骨、软骨以及脂肪的能力。间充质系干细胞由于有望成为细胞治疗的细胞源而备受瞩目，最近，得知其还存在于胎盘、脐带、胎膜等胎儿附属物。

现在，间充质干系细胞因除了分化能力以外还具有免疫抑制能力而备受瞩目，用骨髓来源的间充质系干细胞治疗造血干细胞移植时的移植物抗宿主反应(GVHD)、以及作为炎性肠病的Crohn病的疗效有所进展。本发明人等针对胎儿附属物来源的间充质系干细胞对免疫相关疾病的临床应用进行了研究。目前为止，本发明人等公开了下述内容：胎儿附属物来源的间充质系干细胞具有与骨髓来源的间充质系干细胞同样的分化能力(非专利文献6)、胎膜来源的间充质系干细胞改善了大鼠自身免疫性心肌炎模型的病情(非专利文献7)、以及脐带来源的间充质系干细胞改善了小鼠移植物抗宿主反应(GVHD)模型的救活率(非专利文献8)。胎儿附属物来源的间充质系干细胞较骨髓来源的间充质系干细胞能够得到更多的间充质系细胞，能够短时间、低成本地大量培养，能够非侵入地进行采集，免疫抑制效果也高(非专利文献7)。由此可见，包括胎儿附属物来源的间充质系干细胞在内的MSC由于其明显的免疫抑制效果，能够用于以各种免疫相关疾病为对象的细胞治疗。

目前为止，公开了从作为胎儿附属物的胎膜、胎盘以及羊水获得人胎儿来源的多能干细胞的方法(专利文献1)。在专利文献1中，记载了将这些干细胞视为c-kit(CD117)阳性用流式细胞仪进行分离的方法。另外，还公开了从胎盘以及脐带获得能够分化为成人或小儿的各种细胞的干细胞·祖细胞的方法(专利文献2)。在专利文献2中，记载了对包含于胎盘以及脐带中的具有分化成构成各种脏器、组织的细胞的能力(＝具有间充质系细胞以上的分化能力)的干细胞·祖细胞进行分离的方法。

分离这些包含胎儿附属物来源的干细胞以及祖细胞的细胞时，通常使用胰蛋白酶、胶原蛋白酶或中性蛋白酶等分解酶(专利文献1以及2、非专利文献1～4)。在胎儿附属物中，胎膜分为与羊水接触且位于最接近胎儿侧的羊膜和位于其外侧的绒毛膜，胎膜(羊膜以及绒毛膜)来源的MSC通常也用分解酶进行分离(非专利文献1以及4)。

作为胎儿附属物的胎膜的一部分的羊膜分为与羊水接触的上皮细胞层、和位于其下且包含MSC的细胞外基质层(图1)。因此，将羊膜整体用胰蛋白酶进行处理时，不仅细胞外基质层，支持上皮细胞层的基底膜也被消化，结果，存在成为上皮细胞和MSC的混合物的问题。作为解决该问题的方法，有非专利文献1～3所示的方法：为了从羊膜高纯度地分离MSC，预先用分解酶或手工除去上皮细胞，再将剩余的细胞外基质层用分离酶进行处理，回收MSC的方法。但这些方法存在无法完全去除上皮细胞、或MSC的回收量降低等问题。

另外，将胎膜MSC根据需要用于细胞治疗用途时，必须进行冷冻保存。就目前的研究水平而言，市售有以二甲基亚砜(DMSO)为基本组成的各种细胞冷冻保存液，骨髓MSC的临床试验也使用含有10％的DMSO的冷冻保存液，但存在解冻后细胞的存活率下降的问题。

现有技术文献

[专利文献]

[专利文献1]专利第4330995号