[发明专利]反义寡核苷酸组合物

说明书

本发明涉及反义寡核苷酸(ASO)组合物，并特别涉及用于反义寡核苷酸(ASO)胞质递送的组合物和方法。提供部分单链和部分双链的杂合ASO，杂交形成可非共价地键合至核酸结合蛋白区域的双链区。这样，可生产促进反义DNA向靶细胞中递送的ASO::蛋白复合体。此类复合体可用于下调细胞中的基因表达。

技术领域

本发明涉及反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)组合物，并特别涉及用于反义寡核苷酸(ASO)胞质递送(cytosolic delivery)的组合物和方法。提供部分单链和部分双链的杂合ASO，杂交形成可非共价地键合至核酸结合蛋白区域(nucleic-acid-binding protein regions)的双链区。这样，可产生促进反义DNA向靶细胞中递送的ASO::蛋白复合体。此类复合体可用于下调细胞中的基因表达。

背景技术

反义寡核苷酸已经被FDA批准用作治疗巨细胞病毒(cytomegalovirus)介导的视网膜炎和慢性溃疡性结肠炎的抗病毒药(Roehr,1998；Yacychyn等人，1998)。ASO包括设计为与源自特定基因的信使RNA(mRNA)转录本杂交的单链DNA片段或其类似物。如此形成的mRNA::ASO杂交体可被RNAse H降解。在受病毒感染的生物体中，病毒的遗传物质进入特定细胞以复制，该复制过程需要病毒特异性mRNA的翻译。通过用对病毒mRNA特异的反义寡核苷酸处理受感染的细胞，可防止靶病毒基因表达并阻断病毒生命周期。

反义寡核苷酸治疗有效性的重要因素是寡核苷酸的生物利用度(Biroccio等人，2003)。生物利用度可受到反义寡核苷酸不能穿透细胞的质膜或内膜系统的限制。由于反义寡核苷酸的靶标(如，mRNA)位于细胞的细胞溶胶(cytosol)内，因此寡核苷酸需要在它们接近细胞溶胶之前能够跨过细胞膜。

解决这类反义寡核苷酸的胞质接近(cytosolic access)问题的一种方式是将所述治疗局部施用而不是全身施用，特别是将反义寡核苷酸施用至独立的药代动力学房室，升高反义寡核苷酸的局部浓度。例如，巨细胞病毒-介导的视网膜炎的反义寡核苷酸治疗涉及通过玻璃体内注射将福米韦生(fomivirsen)施用至独立的药代动力学房室。然而，胞质接近，即，反义寡核苷酸向其靶mRNA的接近，即使在玻璃体内施用之后仍存在大量限制(Lysik和Wu-Pong,2003)。

反义寡核苷酸细胞内递送的其它方法可涉及：对细胞膜的机械和电的细胞损伤、高分子和脂质运载体(carriers)(已知非特异性地使膜不稳定)、或病毒载体。然而，这些及类似的方法还未被证明是临床安全或可靠的，并且(迄今为止)市场上还未产生任何批准用于反义产品的递送技术。

发明内容

本发明旨在借助下述新颖排列而提供用于下调细胞内的一种或多种基因的体系中所使用的组合物和方法，所述新颖结构为，活性反义序列(例如单链DNA的活性反义序列)作为部分重叠的第二寡核苷酸链的侧翼，所述部分重叠的第二寡核苷酸链形成可结合至蛋白质的核酸结合结构域的结合位点。我们将这些部分单链和部分双链的核苷酸命名为“ASO杂交体”。出乎意料地，我们已发现并已经验地示出(未公布的数据)：

1)ASO杂交体在无细胞试验中例如以30pMol的ASO浓度可显示与对照的单链反义寡核苷酸相当的反义活性谱。

2)ASO杂交体结合至核酸结合结构域(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)GAL4)来形成复合体，而不需要先前所使用的聚阳离子亲和处理(polycationic affinity handle)(例如聚(L-赖氨酸)(Gaur等人，2002；WO97/23236))或其它共价化学缀合法。