[发明专利]用于3D多尺度显微术的具有集成微镜的微构造表面

说明书

技术领域

本公开内容涉及：用于容纳样品的装置，该装置适于安装至任何显微 镜组合件并且通过单个物镜对一个或更多个样品提供横向照明；该装置在 光学/荧光显微术，特别是但不仅限于选择性平面照明显微术[Selective PlaneIlluminationMicroscopy，SPIM]中的用途；以及用于制造该装置的 方法。

背景技术

光学显微术是基于传播来自受照射的样品的光，所述光经过一组透 镜，从而产生所期望的对象的放大的视图。该基本原理被用于各种显微术 中，但是承受着一系列缺点，例如受限的分辨率和降低的图像清晰度。光 学显微术中的光学分辨率是由光的散射引起的，并且因此难以分辨小于 250纳米的对象。这在z方向(光轴)上甚至更差，其中该限制扩大至500 纳米或更大。然而，许多细胞结构和组分常常小于该光学分辨率极限，而 在分析生物分子的功能和说明细胞过程时确定生物分子(例如蛋白质)在 其自然环境中的性质是重要的。显微镜在生命和材料科学中的应用不断增 多，并且允许在生理条件下对小的对象进行成像的方法是高度期望的。由 于样品的尺寸、组织的散射、色素沉着的缺乏以及细胞组分的移动，所以 活体样品中的分辨率通常低于固定的标本的分辨率。

照明技术例如受激发射损耗(STED)显微术、结构化照明显微术 (SIM)或基于单分子(SM)的技术(PALM/STORM)革新了显微术， 并且使得所谓的超高分辨率成为可能。虽然这些技术与传统的照明方法相 比提供了在空间分辨率方面的明显的优点，但是创建这些图像需要复杂的 仪器和数据分析。这些技术对活体生物样品的深度成像能力不佳。

荧光光片显微术已变得日益普及并且更适于对活体细胞进行成像。基 于光片的显微术背后的构思是，在检测光器件的焦平面周围明确限定的体 积内，仅从垂直于观察方向的侧面照射样品的一个薄层。该技术不需要使 用强激光，使得其为微创的并且减少光漂白。

在广泛采用的光片技术，即选择性平面照明显微术(SPIM)中，圆 柱形光器件或者通过振镜的扫描用于创建不同厚度的光片，并且能够适于 不同的样品尺寸：针对较小的样品(20微米至100微米)，可以使得光片 非常薄(约1微米)，而针对较大的样品(1毫米至5毫米)，该片必须更 厚(约5微米至10微米)以保持在整个视场中的相对均匀。

与落射荧光显微术(epifluorescencemicroscopy)中所使用的检测系 统(其中单个物镜用于照射样品以及沿相同路径采集其荧光两者)相反， SPIM包括：(1)检测透镜，所述检测透镜水平对齐并且浸没在填充有流 体的腔内，嵌入透明凝胶中并且浸没在腔介质中的样品从顶部固定；(2) 激发透镜，所述激发透镜垂直于检测透镜的光轴来照射样品；以及(3) 单个圆柱形透镜，或者振镜，所述单个圆柱形透镜或者振镜通过激发透镜 在腔内形成光片。通过沿检测轴以逐步方式移动样品来获取一叠图像。

虽然荧光光片显微术原则上解决了其他技术遇到的一些限制，但是复 杂的机器和困难的设置使得该方法不适于常规实验室实践。如上所述，荧 光光片显微术需要将两个物镜垂直并且接近样品放置，这除了独特的机器 外还需要特殊的样品保持器，并且阻止了使用高NA物镜和常规的盖玻 片。明显的是，没有能够解决下述问题的最佳解决方案：用由基于SM的 超分辨率显微术提供的尽可能最佳的纳米级分辨率对整个单细胞进行3D 成像。

本公开内容涉及用于容纳样品的装置，该装置适于安装至任何显微镜 组合件，并且为装置中所包含的一个或更多个样品提供光片显微术。装置 包括样品孔，其中所述孔的一个或更多个侧面设置有成角度的反射表面， 所述反射表面适于使光片反射横向通过样品，以提供可由单个物镜检测的 荧光图像。通过相同的物镜来进行光片和荧光采集。所述装置为与高分辨 率荧光显微术关联的前述问题提供了简化且廉价的解决方案。本公开内容 提供了单物镜SPIM[soSPIM]方法，并且允许由阵列微镜芯片在标准的倒 置显微镜上进行SPIM成像。通过相同且唯一的单个物镜来进行检测和激 发。装置可以缩放以包括各种尺寸的反射表面(例如，从20微米至2毫 米)，并且在使用合适放大率的物镜(例如，从100×至10×)的情况下， soSPIM系统允许在相同的仪器上进行3D高分辨率和3D超分辨率的从单 个细胞至整个有机体水平[例如，胚胎成像]的3DSPIM。