[发明专利]用于抗体表达的双顺反子表达载体以及用其生产抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于抗体表达的双顺反子表达载体、用该表达载体转染的动物细胞、 和包括培养该动物细胞的抗体生产方法，其中所述表达载体包含第一表达盒和第二表达 盒，所述第一表达盒包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-抗体轻链基因-polyA”，所述第 二表达盒包含“启动子-UTR-内含子-抗体重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基 因-polyA”。

背景技术

通过遗传重组已经产生了各种人蛋白。然而，由于真核细胞专有的一系列过程，例 如糖基化和磷酸化，具有正常生物学活性的蛋白往往只在利用哺乳动物细胞时合成。常用 作治疗性抗体的免疫球蛋白G(IgG)基因由重链基因和轻链基因构成。各自基因产生的重链 和轻链在胞内的折叠过程中连接并释放出细胞。作为哺乳动物细胞的中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞常用于产生重组抗体(Kaufman等.,Mol.Cell.Biol.(1985)5,1750)。

在用于构建能在哺乳动物细胞中诱导更强而稳定的基因表达的重组表达载体的 各种方法中，代表性的方法是通过选择强启动子来增加基因表达效率。启动子是DNA上一位 点，其中由于存在各种转录因子的结合位点和TATA盒，RNA聚合酶能与之结合并启动mRNA合 成，而基因表达水平在很大程度上取决于该启动子的性能而有所不同。为改进抗体的表达， 诱导高的组成型表达是合适的，代表性的强启动子的例子可包括猿病毒40(SV40)启动子、 巨细胞病毒(CMV)启动子、延长因子1-α(EF1-α)启动子等。

除了利用强启动子增加载体本身合成mRNA的能力的方法，可采用基因扩增系统来 增加治疗性蛋白的生产率。这种方法概述如下。细胞用外来基因转染，并且只有该外来基因 掺入染色体的细胞可通过添加化学物质得到选择性培养。然后，分离选择性培养的细胞，将 用量增加的化学物质加入细胞培养物以诱导掺入到选择性培养的细胞的染色体中的外来 基因扩增。基因扩增中使用的代表基因包括二氢叶酸还原酶(在下文中，DHFR)和谷氨酰胺 合成酶(在下文中，GS)。用于扩增扩增基因的化学物质类型包括用于DHFR的甲氨蝶呤(在下 文中，MTX)和用于GS的甲硫氨酸亚砜胺(在下文中，MSX)。可以通过基因扩增方法制备含有 高于1000拷贝的扩增的外来基因的细胞系。

构建能组成型表达抗体基因的细胞系的常规方法包括这样的方法，其中将包含所 需重链和轻链基因的质粒载体DNA与具有扩增基因的载体DNA共同转染入细胞，并分离在染 色体中整合了两种载体DNA的细胞系(Kaufman,MethodsinEnz.(1990)185,487)，或是这 样的方法，其中利用SV40启动子构建表达扩增基因的载体，然后分离在染色体中整合了载 体的细胞系。

作为表达扩增基因的另一方法，可利用双顺反子载体(bicistronicvector)。与 原核细胞不同，真核细胞在原则上通过一个启动子产生单一的mRNA，仅翻译相应的基因以 合成蛋白质。然而，一些病毒在它们mRNA序列的中部具有核糖体结合序列，因此可以从单一 mRNA合成多个蛋白。当抗体基因和扩增基因由不同启动子表达时，可能仅有扩增基因而非 抗体基因在基因扩增期间扩增。然而，可利用内部核糖体进入位点(IRES)解决该问题，从而 利用同一启动子表达(多个)基因。然而，利用双顺反子载体的方法也具有不能大规模制备 所需蛋白的缺点，因此需要更强大的方法。

同时，贝伐单抗(也称为)是基因泰克(Genentech，美国)开发的针对VEGF的人源化抗体，其起到血管生成抑制剂的作用，并作为主要用于治疗结肠直肠癌、肺癌、肾癌、脑癌等的治疗性抗体已得到广泛关注。托珠单抗(Tocilizumab,也称为)是由罗氏公司(Roche，瑞士制药公司)开发的针对IL-6受体的人单克隆抗体，已在美国、欧洲和日本以Actemra为产品名称批准作为类风湿性关节炎的治疗剂。狄诺塞麦(Denosumab，也称为)是安进公司(Amgen，美国)开发的针对NF-kB配体(RANKL)的受体激活剂的人单克隆抗体，已在美国、加拿大和欧洲以Prolia为产品名称批准作为骨质疏松症的治疗剂，还在欧洲以Xgeva为产品名称批准作为预防具有实体癌骨转移的患者骨折的药物。