[发明专利]用于大量生产人凝血因子VII衍生物的方法

权利要求书

1.用于大量生产人凝血因子VII衍生物的方法，包括：

a)构建表达载体，所述表达载体包括i)其GC富集区缺少至少一个CCGCCC重复序列的二氢叶酸还原酶启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列，和ii)巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码人凝血因子VII衍生物的核苷酸序列；

b)用步骤a)的表达载体转染动物细胞系；

c)在二氢叶酸还原酶抑制剂存在的情况下培养步骤b)的转染动物细胞系，以选择能够高效表达人凝血因子VII衍生物的细胞系；和

d)通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养从步骤c)选择的动物细胞系。

2.权利要求1所述的方法，其中所述GC富集区包括一个或更少CCGCCC重复序列。

3.权利要求1所述的方法，其中所述编码人凝血因子VII衍生物的核苷酸序列具有SEQIDNO：8的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的方法，其中所述表达载体是图1中描述的pXOGC-FVII。

5.权利要求1所述的方法，其中步骤b)的所述动物细胞系选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、猴肾细胞系(COS7)、NSO细胞系、SP2/0细胞系、W138、幼仓鼠肾(BHK)细胞系、MDCK、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞系和293细胞系。

6.权利要求5所述的方法，其中所述动物细胞系是二氢叶酸还原酶基因缺陷型的。

7.权利要求1所述的方法，其中步骤c)选择的细胞系是HMF709(登录号KCTC12022BP)。

8.权利要求1到7中任一项所述的方法，其中步骤d)的丁酸钠的浓度为0.1mM到4.0mM。

9.权利要求8所述的方法，其中当步骤d)的培养温度为32.5℃到35.0℃时，丁酸钠的浓度为1.1mM到3.5mM。

10.权利要求8所述的方法，其中当步骤d)的培养温度为31℃到32.5℃时，丁酸钠的浓度为1.2mM到2.0mM。

11.权利要求8所述的方法，其中当步骤d)的培养温度为33.0℃时，丁酸钠的浓度为1.5mM。

12.权利要求1到7中任一项所述的方法，其中步骤d)的维生素K是维生素K1。

13.权利要求1到7中任一项所述的方法，其中步骤d)的维生素K的浓度为0.1mg/L到3mg/L。

14.权利要求1到7中任一项所述的方法，其中步骤d)的所述培养基附加剂是大豆水解物或酵母提取物。

15.权利要求14所述的方法，其中步骤d)的所述培养基附加剂是酵母提取物。

16.权利要求14所述的方法，其中0.1g/L到3g/L浓度的大豆水解物或酵母提取物被添加至培养基。

17.权利要求1所述的方法，其进一步包括纯化所述人凝血因子VII衍生物。

18.权利要求1所述的方法，其进一步包括活化所述人凝血因子VII衍生物。

19.能够生产人凝血因子VII衍生物的HMF709细胞系(登录号KCTC12022BP)。

20.用于大量生产人凝血因子VII衍生物的方法，所述方法包括通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养能够生产人凝血因子VII衍生物的HMF709细胞系(登录号KCTC12022BP)。