[发明专利]用于大量生产人凝血因子VII衍生物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于大量生产人凝血因子VII衍生物的方法和用于大量生产人凝血因子VII衍生物的细胞系，所述方法包括：a)构建表达载体，所述表达载体包含i)其GC富集区缺少至少一个CCGCCC重复序列的二氢叶酸还原酶(下文中的DHFR)启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码DHFR的核苷酸序列，和ii)巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码人凝血因子VII衍生物的核苷酸序列；b)用步骤a)的表达载体转染动物细胞系；c)在DHFR抑制剂存在的情况下培养步骤b)的转染动物细胞系，以选择能够高效表达人凝血因子VII衍生物的细胞系；和d)通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养从步骤c)选择的动物细胞系。

背景技术

在肝脏中产生并被分泌到血液中的人凝血因子VII(下文中的FVII)是丝氨酸蛋白酶的前体，丝氨酸蛋白酶通过激活凝血因子X或凝血因子IX引起血液凝结(clot)。FVII是具有50,000Da分子量的单链糖蛋白。FVII通过因子Xa、因子XIIa、因子IXa和凝血酶变为活性形式，即分解成双链形式的因子VIIa。已知FVII通过结合至带负电的磷脂A而加强酶活性(Nemerson等,Thromb.Res,1985,40:351～358)。

在组织因子和钙离子存在的情况下，因子VIIa将因子X活化为因子Xa，其进而在因子5a、钙离子和磷脂存在的情况下使凝血酶原转化为凝血酶，由此进行体内凝血。

总共由406个氨基酸组成的FVII通过精氨酸(第152位氨基酸)和异亮氨酸(第153位氨基酸)之间的单肽键之间的断裂被活化为因子VIIa。结果是，因子VIIa获得这样的结构：其中轻链(由152个氨基酸残基组成)和重链(由254个氨基酸残基组成)经二硫键结合在一起。轻链具有γ羧基谷氨酸结构域(Gla)和两个表皮生长因子(EGF)结构域，而重链具有丝氨酸蛋白酶活性位点。

为了在N-末端形成10个羧基谷氨酸(涉及到因子VIIa的生物活性)，需要维生素K(Hagen等.,Natl.Acad.SC.U.S.A,1986,83:2412～2416)。已知这种Gla-结构域涉及结合FVII至包含组织因子的细胞表面(Sakai,等.,J.BiolChem,1990,265:1890～1894)。

目前，有两种生产因子VIIa的方法。第一种方法涉及从血浆中分离并纯化FVII和活化FVII形成因子VIIa(Broze,等.,J.Biol.Chem,1980,225:1242～1247)。第二种方法涉及通过培养插入了FVII的DNA序列的动物细胞来获得因子VIIa(欧洲专利申请号：86302855.1)。

血浆衍生产品具有低生产效率和供应不稳定性，并且具体地，其在安全性方面具有高风险。相对而言，基因重组产品能够利用基因工程技术克服血浆衍生产品的不足。

但是，利用基因重组技术在动物细胞中生产FVII在大多数情况下由于其低表达而具有生产率低的问题。因此，关于使用FVII作为治疗剂，需要建立能够实现大规模生产的细胞系。进一步地，研制高效表达的表达载体对于建立细胞系是至关重要的。

发明内容

技术问题

发明人做出了大量工作以找到用于大量生产FVII及其衍生物的方法。结果是，已构建出用于能够利用带有缺少GC富集重复序列的DHFR启动子的载体高效表达FVII的动物细胞系的表达载体，并且已用该表达载体转染动物细胞系，以构建能够稳定地大规模生产FVII的单克隆转染子。当发明人添加了从低到高水平范围的浓度的丁酸钠和维生素K并培养转染子以增加单克隆的FVII衍生物生产水平时，证实在通过添加高浓度的丁酸钠和维生素K培养时，FVII衍生物的表达显著提高，从而完成了本发明。

技术方案

本发明的一个目标是提供大量生产FVII衍生物的方法，所述方法包括：a)构建表达载体，该表达载体包含i)其GC富集区缺少至少一个CCGCCC重复序列的DHFR启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码DHFR的核苷酸序列，和ii)CMV早期基因启动子的核苷酸序列、和与其可操作地连接的编码FVII衍生物的核苷酸序列；b)用步骤a)的表达载体转染动物细胞系；c)在DHFR抑制剂存在的情况下培养步骤b)的转染动物细胞系，以选择能够高效表达FVII衍生物的细胞系；和d)通过添加选自丁酸钠、维生素K和培养基附加剂的至少一种，培养从步骤c)选择的动物细胞系。