[发明专利]用于生产双特异性抗体的细胞的制备和挑选

说明书

技术领域

本申请为关于产生和挑选适于生产双特异性抗体的细胞的组合物和方法。

背景技术

治疗性蛋白产品如抗体的有效生产，需要进行适于该产品的细胞系的开发和鉴别。多年以来，细胞系开发经历了几次改进，特别是为了满足使用如此复杂的宿主作为生产平台时，缩减时间和成本的需求。在细胞系开发和细胞工程方法中产生的改进能够用于增加产量，促进细胞代谢，控制增殖和凋亡，以及降低不稳定性。

考虑到抗体的相对大的尺寸和复杂的翻译后修饰，抗体的生产存在独特的挑战性。尤其是那些包含两个独立结合单元的，需要在一个细胞中同时表达两个单元的双特异性抗体，更难以生产。

发明内容

技术问题

本申请，在一个实施例中，提供适于生产双特异性抗体的细胞的制备方法和组合物。一方面，多个真核细胞在与一种试剂孵育的条件下使细胞停留在G1/S期。然后该试剂从细胞中去除，，细胞转染包含编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元序列的第二载体。从多个细胞中鉴别出同时表达第一和第二抗原结合单元的细胞。

问题解决方案

技术解决方案

在一个实施例中，提供一种用于制备适于生产双特异性抗体的细胞的方法，所述方法包括：(a)多个真核细胞与一种试剂孵育，在此条件下使细胞停留在G1/S期；(b)从该细胞中去除该试剂；(c)该细胞转染包含编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元序列的第二载体；和(d)从多个细胞中鉴别出同时表达第一和第二抗原结合单元的细胞。在某些方面，所述试剂为胸苷。

在某些方面，所述第一或第二载体进一步包含编码荧光蛋白的序列。

在某些方面，每个载体进一步包含编码显示不同荧光的荧光蛋白的序列。

在一个实施例中，还提供细胞生产和分泌双特异性抗体的测定方法，其中该细胞已转染包含编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元的序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元的序列的第二载体，所述方法包括：(a)将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和第一抗原和(ii)第二抗原接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述第一抗原结合至第一抗原结合单元，第二抗原结合至第二抗原结合单元；和(b)第二抗原连接到细胞的检测，由此测定该细胞生产和分泌包含该第一抗原结合单元和该第二抗原结合单元的双特异性抗体。

在某些方面，第二抗原是由第一荧光颜色荧光标记的，其中所述检测包括鉴别显示该第一荧光颜色的细胞颗粒。

在某些方面，第二抗原是由第一荧光颜色荧光标记的，且所述载体的至少之一包含编码具有第二荧光颜色的荧光蛋白的序列，其中所述检测包括鉴别同时显示第一荧光颜色和第二荧光颜色的细胞颗粒。

在一个实施例中，还提供一种方法，测定细胞生产和分泌双特异性抗体，其中该细胞已转染包含编码针对第一抗原具有特异性的单价抗原结合单元、单链可变片段(scFv)序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的重链和轻链两者共同形成单价抗原结合单元序列的第二载体，所述方法包括：(a)将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和第一抗原，和(ii)具有轻链特异性的抗体接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述第一抗原结合至第一抗原结合单元，并且该抗体结合至轻链；和(b)检测该抗体连接至细胞，由此测定该细胞生产和分泌双特异性抗体，该抗体包含scFv和具有重链和轻链的抗原结合单元。

在某些方面，该抗体由第一荧光颜色所荧光标记，并且其中该检测包括鉴别显示第一荧光颜色的细胞颗粒。在某些方面，该抗体由第一荧光颜色所荧光标记，并且第一载体进一步包含编码具有第二荧光颜色的荧光蛋白的序列，其中该检测包括鉴别同时显示第一荧光颜色和第二荧光颜色的细胞颗粒。