[发明专利]泡状接头及其在核酸文库构建及测序中的应用

权利要求书

1.一种构建单链环状文库的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)对双链DNA片段进行末端修复，从而获得平末端的DNA片段；

(b)对上一步骤的所述平末端的DNA片段的3'端添加碱基A，得到3'端加A的DNA片段；

(c)对上一步骤的所述3'端加A的DNA片段，用寡核苷酸泡状接头进行连接反应，从而获得两端添加泡状接头的DNA片段；

(d)将上一步骤中得到的所述两端加泡状接头的纯化DNA片段作为模板，用针对所述接头序列的特异性引物对进行PCR扩增，从而获得DNA扩增产物，其中所述引物对中的一条引物标记有生物素；

(e)对上一步骤中得到的所述DNA扩增产物，用包被有亲和素的珠子通过“亲和素-生物素”的结合进行分离，从而获得单链DNA；

(f)对上一步骤中得到的所述单链DNA，在单链环化分子的存在下，进行单链环化反应，从而获得含环化产物的混合物,即为单链环状文库；

其中，所述寡核苷酸泡状接头具有位于两端的互补碱基序列区，以及位于所述互补碱基区之间的泡状非匹配碱基序列区；

所述泡状非匹配碱基序列区具有非匹配的第一链泡状序列区和第二链泡状序列区，并且所述第一链泡状序列区的长度大于所述第二链泡状序列区的长度；

所述互补碱基序列区包括5’双链配对区和3’双链配对区，并且所述3’双链配对区的末端为粘性末端，所述5’双链配对区的末端碱基经过磷酸化修饰。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的3’双链配对区的粘性末端具有突出的单碱基。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述突出的单碱基为T。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一链泡状序列区的一部分或全部是作为测序引物结合区。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的测序引物结合区包括任选的上游互补碱基序列区的部分序列、第一链泡状序列区的部分或全部序列和任选的下游互补碱基序列区的部分序列。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述泡状接头的长度为25-50nt。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述泡状接头的长度为30-45nt。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一链泡状序列区比第二链泡状序列区的长度长至少5-30nt。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5’双链配对区的末端为平末端或粘性末端。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的粘性末端具有非匹配的1-3个碱基。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述泡状接头为具有正义链和反义链的双链结构，并且具有式I所示的从5'至3'的结构：

Y0-Y1-Y2 (I)

式中，

Y0为5’双链配对区，长度为10-15nt；

Y1为双链非配对区，其中所述非配对区中的正义链的长度比反义链的长度大5-30nt；

Y2为3’双链配对区。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述Y0的长度为11nt。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的泡状接头序列为：

5’-GTCCTAAGACCNGATCGGGCTTCGACTGGAGACTCCGACTT-3’以及

5’-/phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGACAT-3’。