[发明专利]泡状接头及其在核酸文库构建及测序中的应用

说明书

提供了一种泡状接头和利用该接头构建的单链环状文库，所述文库可用于RNA测序及其它依赖单链环状文库的测序平台，具有测序通量高、准确度高和操作简便的优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种泡状接头和利用该接头构建核酸文库及测序方法。

背景技术

第二代测序技术,又称新一代测序技术,是相应于以Sanger测序法为代表的第一代测序技术而得名。第二代测序中以Roche/454焦磷酸测序、Illumina/Solexa聚合酶合成测序和ABI/SOLiD连接酶测序为代表，它们的共同特点是具有很高的测序通量。而与这些主流测序平台相比，Complete Genomics(简称CG)测序平台的通量最高，每次运行可产生9.9TB的数据量，且每小时的产量可以达到50Gb，是目前主流测序平台的10-25倍。在单倍体读长方面，主流测序平台中只有illumina公司的测序仪可以实现8-10kb的单倍体读长，而CG测序仪则可以达到大于99kb。此外，CG测序仪的准确度可以高达99.999％，优于目前其他商业化的测序仪。由此可见，相较于主流测序平台，CG测序平台有着其特有的优势。

在构建核酸测序文库过程中，一般都需要引入已知序列的接头才可进行测序。而目前报道的核酸测序文库的接头连接方法，常常出现连接效率不高，副产物多的情况。此外，由于CG测序平台采用单链环状文库进行测序，因此主流测序平台通常构建的双链线性文库并不适用于CG测序仪。对于核酸测序中单链环状文库的构建方法，目前还没有相关文献报道过。

基于以上情形，本领域迫切需要开发连接效率和精准度高的接头。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于高效地制备核酸测序的单链环状文库的泡状接头。

本发明的另一目的是提供所述泡状接头用于单链环状文库的构建和测序方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于构建核酸文库的寡核苷酸泡状接头，所述接头具有位于两端的互补碱基序列区，以及位于所述互补碱基区之间的泡状非匹配碱基序列区；

所述泡状非匹配碱基序列区具有非匹配的第一链泡状序列区和第二链泡状序列区，并且所述第一链泡状序列区的长度大于所述第二链泡状序列区的长度；

所述互补碱基序列区包括5’双链配对区和3’双链配对区，并且所述3’双链配对区的末端为粘性末端，所述5’双链配对区的末端碱基经过磷酸化修饰。

在另一优选例中，所述的3’双链配对区的粘性末端具有突出的单碱基。

在另一优选例中，所述突出的单碱基为T。

在另一优选例中，所述第一链泡状序列区的一部分或全部是作为测序引物结合区。

在另一优选例中，所述的测序引物结合区包括任选的上游互补碱基序列区的部分序列、第一链泡状序列区的部分或全部序列和任选的下游互补碱基序列区的部分序列。

在另一优选例中，所述泡状接头的长度至少为20nt，较佳地为25-50nt、更佳地为30-45nt。

在另一优选例中，第一链泡状序列区比第二链泡状序列区的长度长至少5-30nt。

在另一优选例中，所述的5’双链配对区的末端为平末端或粘性末端。

在另一优选例中，所述的粘性末端具有非匹配的1-3个碱基。

在另一优选例中，所述的泡状接头为具有正义链和反义链的双链结构，并且具有式I所示的从5'至3'的结构：

Y0-Y1-Y2 (I)

式中，

Y0为5’双链配对区，长度为10-15nt，较佳地为11nt；