[发明专利]一种非诊断目的检测ApoA5生物学活性的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白活性检测领域，特别涉及一种非诊断目的检测ApoA5生物学活性的方法及试剂盒。

背景技术

随着现代生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖的发生率越来越高，同时肥胖所伴随的脂质增加，异位沉积增多使得肥胖相关的疾病发病率逐年增高。因此，有效的降低肥胖伴随的脂质沉积是当今医学面临的重要挑战。

肥胖是由于能量摄入与能量消耗不平衡导致脂肪细胞储存过多甘油三酯(TG)，细胞体积异常增大的结果，其根源是脂代谢异常。而脂代谢异常的实质是指脂蛋白和载脂蛋白的异常，载脂蛋白作为脂蛋白中的蛋白质部分，不仅在结合和转运脂质、稳定脂蛋白的结构上发挥重要作用，而且还具有调节脂蛋白代谢关键酶的活性，参与脂蛋白受体的识别的作用，它参与了人体脂类代谢的全过程。目前已发现多个与脂代谢中有重要作用的载脂蛋白，如ApoA1、ApoA2、ApoA4、ApoB48、ApoB100、ApoC1、ApoC2、ApoC3和ApoE等。

ApoA5是2001年发现的一种载脂蛋白，目前的研究证实其与肥胖及代谢综合征的发生有着密切的关系。已有的研究证实，ApoA5能显著降低血液中TG，同时ApoA5能够被脂肪细胞摄取，滞留于脂滴表面，并降低脂肪细胞中的TG，因此，ApoA5被认为是能够有效调节脂质沉积的载脂蛋白，未来有可能运用于肥胖患者，达到降低血液中的脂质的目的。而目前ApoA5主要是通过质粒转染来获得，因此检测合成的ApoA5的生物学活性至关重要，可为进一步研究ApoA5对脂质的调控奠定基础，为其将来运用于临床有重要的意义。

目前，检测ApoA5生物学活性的方法较少。因此，提供一种检测ApoA5生物学活性的方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种非诊断目的检测ApoA5生物学活性的方法及试剂盒。该检测方法通过检测LRP1沉默后HL-1心肌细胞/脂肪细胞对ApoA5的摄取情况可准确检测ApoA5的生物学活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种非诊断目的检测ApoA5生物学活性的方法，包括如下步骤：

将细胞与放射性核素标记的ApoA5孵育，去除细胞膜上结合的ApoA5，裂解细胞，检测细胞裂解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第一放射活性；

将细胞与LRP1小干扰RNA混合，获得沉默LRP1表达的细胞；将沉默LRP1表达的细胞与放射性核素标记的ApoA5孵育，去除细胞膜上结合的ApoA5，裂解细胞，检测细胞裂解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第二放射活性；

比较第一放射活性与第二放射活性，获得ApoA5生物学活性。

研究发现HL-1心肌细胞对ApoA5的摄取主要通过细胞膜上的受体介导来完成，其中低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)在摄取ApoA5的过程中起主要作用。本发明通过放射性同位素¹²⁵I标记ApoA5，同时用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术沉默HL-1心肌细胞/脂肪细胞LRP1受体的表达，并与对照组比较，观察LRP1沉默后HL-1心肌细胞/脂肪细胞摄取ApoA5的变化情况。若LRP1沉默后HL-1心肌细胞/脂肪细胞内¹²⁵I-ApoA5的含量较对照组减少，说明HL-1心肌细胞/脂肪细胞部分通过LRP1介导来摄取ApoA5，同时也印证了ApoA5具有生物学活性。

为了使HL-1心肌细胞/脂肪细胞摄取具有生物学活性的ApoA5，需将细胞与ApoA5进行孵育。在本发明提供的一些实施例中，孵育的时间为1～5小时，温度为37℃。

作为优选，孵育的时间为2小时，温度为37℃。

为了获得细胞摄取ApoA5的情况，需将ApoA5进行放射性核素标记。在本发明提供的一些实施例中，放射性核素为¹²⁵I。

在本发明提供的一些实施例中，LRP1小干扰RNA的浓度为1～10nmol/L。

作为优选，LRP1小干扰RNA的浓度为5nmol/L。

在本发明中将LRP1小干扰RNA与细胞进行混合，使得LRP1小干扰RNA沉默细胞膜上LRP1的表达。在本发明提供的一些实施例中，混合的时间为4～8小时。

作为优选，混合的时间为6小时。