[发明专利]兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶及其应用

权利要求书

1.兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的重组酶形成的用于克隆外源基因至载体靶位点的组合物。

3.权利要求2所述的组合物，其特征在于，包含所述重组酶，以及反应缓冲液，所述反缓冲液配比为：

50-500mM Tris-HCl,pH7.5

10-50mM  MgCl₂

50-200mM KCl

10-100mM (NH₄)₂SO₄

0.01-0.2% BSA。

4.权利要求2或3所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的应用,其特征在于,具体包括如下步骤：

1)延长外源DNA：将外源DNA的两条引物5’端和3’端分别加上与线性载体末端序列一致的，且核苷酸长度≥12bp的碱基序列；

2)将所述的组合物、线性载体、外源DNA混合形成反应体系；

3)孵育反应体系以获得中间产物；

4)将中间产物进行细胞转化,获得转化细胞；

5)培养该转化细胞,获得包含外源DNA的重组DNA分子。

5.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤1）所述的延长外源DNA通过聚合酶链式反应(PCR)来制备。

6.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤3）所述的孵育温度为22-25℃，时间20-40分钟。

7.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤4）所述的转化细胞为Top10 大肠杆菌感受态细胞。

8.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤4)和5)中的转化和培养条件具体如下:

a.5μl加入至50μl Top10 大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置20分钟；

b.42℃加热90秒钟后，再在冰上放置5分钟；

c.加入945μl带有 Amp抗性的LB培养基，37℃振荡培养40分钟;

d.以5000rpm的速度离心3分钟,倒掉上清液,取20μl铺板,得到含有外源DNA的单克隆抗体。

9.一种用于克隆外源基因至载体靶位点的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含：组成成分以及使用这些组合成分的说明书；所述的组成成分包括：

1）线性载体；

2）延长了的外源DNA：外源DNA的两条引物5’端和3’端分别加上与线性载体末端序列一致的,且核苷酸长度≥12bp的碱基序列；

3）权利要求1所述的重组酶；

4）权利要求2所述的反应缓冲液。

10.权利要求9所述的试剂盒在克隆外源基因至载体靶位点中的应用。