[发明专利]兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种新型的兼具核酸外切和单链DNA交换活性的通过人工合成的重组酶及其应用。

背景技术

DNA克隆和亚克隆以当今生物技术产业和分子生物学为基础，如今市场上将若干个DNA片段连接起来以及将目的片段克隆到目标载体靶位点的需求一直持续不断，传统的将外源基因导入载体靶位点中的方法通常包括以下几个步骤：(1)首先要用一种或多种限制性内切酶将载体进行酶切，将载体线性化；(2)用碱性磷酸酶处理线性载体防止连接过程中载体的重新环化；(3)利用引物进行外源DNA的PCR扩增反应；(4)利用同样的限制性外切酶处理扩增后的外源DNA产物并纯化；(5)将载体与外源DNA连接；(6)将连接产物转化到受体细胞中，比如大肠杆菌，并筛选出包含目的DNA片段的重组子。传统的克隆方法繁琐费时，克隆效率相对较低，并且受限于载体和外源基因上的的限制性酶切位点。

近来基于重组的克隆方法已经大大加快了克隆的速度，Pentao Liu等（2003）阐述了一种不依靠限制性内切酶和连接酶，只利用E.coli噬菌体同源重组来获得基因敲除产物的重组方法，该方法利用噬菌体红蛋白及重组酶Cre、Flpe通过空缺修复把来自于BAC人工染色体中的DNA导入高拷贝的质粒中，进而将LoxP,FRT位点融合到亚克隆DNA中，此方法中的同源区域长度超过45-55bp。和其他重组方法类似，这一方法依靠于宿主细胞中特异性表达的噬菌体蛋白与载体之间的特异序列区域，因此受限于特殊的载体和宿主细胞。

另一个基于重组克隆的例子是由Clonetech Laboratories开发的In-Fusion^TM PCR试剂盒，该试剂盒可以在无任何限制性内切酶和连接酶的情况下，将任意片段导入任意线性载体中，此款In-Fusion^TM 系列通过将引物末端加上15bp的与线性载体末端同源的碱基，进而把PCR产物的末端插入到线性载体的同源序列中。这种方法首先要对线性载体、PCR产物以及酶的混合物进行30分钟孵育，再转化到大肠杆菌中。此方法中的In-Fusion酶可以将双链DNA产物转变成单链，并融合到线性载体的同源序列中。此种方法不受宿主细胞与载体限制，即可实现PCR产物的快速克隆，但是由于In-Fusion酶的专有性，因此制约了In-Fusion^TM PCR试剂盒以及Clonetech公司生产的其他类似试剂盒的使用。

而最新的案列是GenScript公司所开发的CloneEZ^TM 试剂盒,基于之前的专利，此方法是利用一种含有核酸外切酶和单链DNA结合蛋白的酶复合物来实现的同源重组方法。但酶混合物的选用，依然无法克服克隆效率和稳定性的问题。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种兼具核酸外切和单链DNA交换活性的新型重组酶，以及其在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，采用该新型重组酶将外源基因克隆至载体靶位点的方法，本方法准确率更高,更为简单，使用方便,更为快速,且具有更高的克隆效率和稳定性。

本发明所提供的兼具核酸外切和单链DNA交换活性的新型重组酶，其特征在于,具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种所述重组酶形成的用于克隆外源基因至载体靶位点的组合物。

所述组合物包含所述酶，以及反应缓冲液，所述反应缓冲液配比为：

50-500mM Tris-HCl,pH7.5

10-50mM  MgCl₂

50-200mM KCl

10-100mM (NH₄)₂SO₄

0.01-0.2% BSA。

本发明还提供了所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）延长外源DNA：将外源DNA的两条引物5’端和3’端分别加上与线性载体末端序列一致的，且核苷酸长度≥12bp的碱基序列；

2）将所述的组合物、线性载体、外源DNA混合形成反应体系；

3）孵育反应体系以获得中间产物；

4）将中间产物进行细胞转化，从而获得转化细胞；

5）培养该转化细胞，获得包含外源DNA的重组DNA分子。

步骤1）所述的延长外源DNA通过聚合酶链式反应（PCR）来制备。