[发明专利]用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR检测的引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR检测的引物，还涉及含有检测引物的试剂盒和检测方法。

背景技术

甘薯病毒病(Sweet potato virus disease，SPVD)是由甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato cholotic stunt virus，SPCSV)和甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)协生共侵染甘薯引起的病毒病害。感染SPVD的甘薯表现叶片扭曲、畸形、叶片褪绿、明脉以及植株严重矮化等症状。SPVD对甘薯产量影响极大，可使甘薯减产50％～98％，严重时可造成90％以上的产量损失，甚至绝收，是甘薯上的毁灭性病害。2012-2013年度SPVD病毒病在我国大面积爆发，在重庆地区爆发造成了严重的影响；因此，建立一种简便、快速、有效的检测SPVD的方法，对于该病的预警和防治具有重要意义。

目前用于甘薯病毒检测目前检测手段有病状学诊断、指示植物检测法、电子显微镜检测法、血清学检测，较为常用方法是酶联免疫吸附(ELISA)技术和PCR技术。由于ELISA技术的灵敏度较低，而且SPLV、SPVG和SPFMV 3种病毒的抗体之间常常有交互反应，不能对3种病毒进行特异性检测。而利用单一的RT-PCR检测方法对多种病毒进行检测时，工作量大，效率低。因此，急需建立一种在一次PCR反应中同时检测上述3种甘薯病毒的多重方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR的检测引物；本发明的目的之二在于提供含有上述检测引物的试剂盒；本发明的目的之三在于提供利用上述试剂盒检测甘薯SPVD病毒病的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR的检测引物，包括甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物，所述甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因的检测引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

2、含有所述检测引物的检测试剂盒。

进一步，所熟检测试剂盒还包括内标基因检测引物，所述内标基因为甘薯泛素基因UBI和甘薯组蛋白H2B基因，所述甘薯泛素基因UBI的检测引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。

3、利用所述检测试剂盒检测甘薯SPVD病毒病的方法，包括如下步骤：

(1)提取检测样品和对照样品总RNA，反转合成第一链cDNA，备用；

(2)根据甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因设计荧光定量PCR的检测引物和内标基因检测引物，然后以步骤(1)合成的第一链cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；

(3)比对检测样品和对照样品的Ct值计算甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的相对表达量。

进一步，所述甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因的检测引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

进一步，所述内标基因为甘薯泛素基因UBI和甘薯组蛋白H2B基因。

进一步，所述甘薯泛素基因UBI的检测引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。

进一步，所述荧光定量PCR的扩增程序为95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，50个热循环。