[发明专利]产醛酮还原酶菌株、基因、酶、载体、工程菌及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种产醛酮还原酶Canidia albicans筛选、醛酮还原酶基因克隆和上述酶基因重组表达载体及重组菌构建，并开发醛酮还原酶及其重组菌在阿托伐他汀手性中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成方面的应用。

(二)背景技术

心脑血管疾病已经成为危害人类身体健康的头号杀手，预计到2020年，心血管疾病死亡人数将占人类总死亡人数的36％。在心脑血管疾病一级和二级预防中，他汀类药物(Statin)能有效抑制胆固醇合成、显著降低心脑血管疾病的事件，已成为动脉粥样硬化疾病治疗的基础药物。2006年，仅阿托伐他汀的销售额达到136亿美元。IMS发布2009年全球药物销售数据，阿托伐他汀累计销售额高居世界畅销药品首位。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲基-3,5-二羟基戊酸，是胆固醇生物合成途径的限速酶。他汀类药物能竞争性抑制HMG-CoA还原酶活性，抑制胆固醇的生物合成。阿托伐他汀是全合成的高效他汀类药物，β,δ-二羟基戊酸是关键的活性结构。阿托伐他汀高效抑制肝脏胆固醇合成，促进肝脏低密度脂蛋白(LDL)受体增加、改变极低密度的脂蛋白颗粒形成。阿托伐他汀在10～80毫克/天剂量范围内降低低密度脂蛋白胆固醇水平41～61％，降低高甘油三酯血症患者血清甘油三酯水平43％。此外，他汀类药物对胆固醇高或者不高、且无心脑血管疾病的人群提供非常好的心血管保护作用，帮助合并糖尿病和高血压的患者合理控制胆固醇水平，标准治疗剂量的他汀可获得非常明显的保护作用。

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀的关键手性合成子。 由于各国药监部门对药物手性纯度要求严格(e.e.值>99.5％，d.e.值>99％)，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的合成技术成为阿托伐他汀合成的关键核心技术。传统的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成工艺从酮酸或者酮酯类化合物出发，通过不对称合成构建手性中心，反应路线复杂，需要使用易燃易爆的硼烷、正丁基锂和深冷等特殊环境，从而导致产物d.e.值低、得率低，能耗大。而且，反应产生的硼化物废物处理困难，需要经过繁琐的甲醇淬灭、真空蒸馏的反复处理。酶具有优异的选择性，反应过程条件温和，一般在常温、常压及近中性条件下即可进行，从而把分解、异构化、外消旋化、重排等不利副反应降到最低限度，基于酶催化的生物合成技术具有过程原子经济性高、反应过程绿色环境友好的优势。因此，开发生物不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯技术，具有巨大的经济、社会和环境效益。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种立体选择性醛酮还原酶产生菌——白假丝酵母(Canidia albicans)，1条来自Canidia albicans醛酮还原酶基因序列、含有上述基因的重组载体及其转化得到的重组基因工程菌，并开发醛酮还原酶工程菌细胞及其纯化酶在6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成方面的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种醛酮还原酶基因，所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，命名为ca-7，全长为930bp。其中，其编码序列(CDS)为：从第一个核苷酸起至第930个核苷酸止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，该条序列无内含子。

本发明所述的重组醛酮还原酶基因来源于环境中分离得到的白假丝 酵母(Canidia albicans)XP1463，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC No：M 2014382，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明所述的醛酮还原酶基因可以从Canidia albicans XP1463基因组中克隆获得，也可以从该醛酮还原酶基因的重组载体中或者重组菌中克隆，也可以人工合成。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1所示的多核苷酸的突变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的突变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列，此多核苷酸的突变体可以是自然发生的等位突变或非自然发生的突变，包括取代突变、缺失突变和插入突变，如本领域所知的同义突变，由一个或多个核苷酸的取代，但不会实质性地改变其编码的多肽链的功能。