[发明专利]桑树类黄酮3‑O‑糖基转移酶基因、蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因(MaUFGT)。

背景技术

花青素(anthocyanin)属于类黄酮化合物，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，也是植物花瓣和果实的主要呈色物质。花青素存在于植物细胞的液泡中，在不同的pH值条件下，使花瓣呈现五彩缤纷的颜色。自然状态下，游离态的花青素极少见，主要以糖苷形式存在，花青素常与一个或多个葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷。花青素具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病及保护肝脏的作用。成熟果实的桑椹，味甜汁多，色泽艳丽，营养丰富，花青素含量极为丰富，这些特征是评价桑椹品质的重要指标。

类黄酮3-O-糖基转移酶(UFGT)以槲皮素为底物，能够催化UDP-葡萄糖生成槲皮素3-β-D-葡萄糖甙，是花青素合成途径的关键基因之一，能将不稳定的花青素转变成稳定的花青苷，该基因的表达决定与否直接影响花青素含量的积累。因此桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因可应用于桑树花青素生物合成的调控，改良桑椹的品质。

研究发现，制约该基因取得进展的主要因素有：(1)蛋白表达量较低或不表达；(2)表达蛋白以包涵体形式存在；(3)包涵体复性后，蛋白没有酶活性。因此，探寻UFGT基因的高表达至关重要，尤其是获得具有活性的蛋白，对该基因的鉴定及功能研究提供了重要的技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因及其氨基酸序列。

一种核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或其互补序列。所述核酸分子编码桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因。

上述核酸分子，其扩增引物为：

UFGT-F：5’>CCGGAATTCATGGCACCATCACCACCTTGCC<3’，

UFGT-R：5’>GAAAGCGGCCGCTATCAGTCTTACAACTCCTT<3’。

一种蛋白分子，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。其为桑树类黄酮3-O-糖基转移酶。

一种载体，包含了上述核酸分子。

上述载体，其结构如图3所示。所述载体是将上述编码桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因作为目的基因导入恰当的载体构成图3所示结构的载体。所述载体中，两个组氨酸标签基因分别位于目的基因上下游两侧，目的基因，组氨酸标签等部分有机组合，为蛋白的纯化、表达量和酶活的提高提供了有利条件。

上述载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明的另一目的在于提供上述桑树类黄酮3-O-糖基转移酶的制备方法，所得蛋白表达量大、酶活性高。

一种桑树类黄酮3-O-糖基转移酶蛋白的制备方法，包括获取目的基因，构建包含目的基因的载体，载体导入宿主菌，从宿主菌中获取目的蛋白、目的蛋白纯化，目的蛋白复性，所述目的蛋白复性是将纯化后的蛋白液依次用透析液I、II、III、IV、V、Vi、VII透析，每种透析液透析4h-8h。

透析液I配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，6M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液II配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，4M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液III配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，2M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液IV配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.1％SDS，1M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液V配方：100mM Tris.HCI，10mM EDTA，0.1％SDS，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VI配方：50mM Tris.HCl，5mM EDTA，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VII配方：20mM Tris.HCl，2mM EDTA，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)。

在桑树类黄酮3-O-糖基转移酶的制备过程中，极易造成蛋白的失活，蛋白液出现白色絮状物或沉淀，本发明所得蛋白液透明，避免沉淀或白色絮状物的产生，而且蛋白液的浓度高，并且不会产生透析袋胀袋问题。