[发明专利]一种重组链霉菌、其构建方法及提高抗生素产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种重组链霉菌及其应用，具体涉及通过改造抗生素前体的合成途径中的关键基因来提高抗生素的产量。

背景技术

链霉菌属革兰氏阳性放线菌，在系统生物学上归于链霉菌属(Strptomyces)，具有复杂生活周期和次生代谢途径。该属的许多成员都能产生多种具有生物活性的次级代谢产物。目前已知的上万种抗生素中，有70％以上是由链霉菌产生的。除此之外，它还能产生免疫抑制剂、抗肿瘤剂、杀虫剂和多种胞外水解酶，如纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和蛋白酶等。

在链霉菌产生次级代谢产物的过程中，氨基酸既可以作为碳源，也可以作为氮源，还有许多氨基酸是一些次级代谢产物的前体，如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸，它们的代谢产物包括乙酰CoA、丙酰CoA、丁酰CoA与异戊酰CoA等，这些物质是大环内酯类抗生素生物合成的前体。如阿维菌素的生物合成(Hafner E W,Holley B W,Holdom K S,et al.Branched-chain fatty acid requirement for avermectin production by a mutant of Streptomyce avermitilis lacking branched-chain 2-oxo acid dehydrogenase activity[J].J Antibiot(Tokyo),1991,44(3):349～356)、螺旋霉素链霉菌产生必特螺旋霉素(李桢林,江维,王永红,等.Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响[J].中国抗生素杂志,2007,32(11):660～668)、醌霉素的生物合成(Yoshida T,Katagiri K.Influence of Isoleucine upon quinomycin biosynthesis by Streptomyces sp.732[J].J Bacteriol,1967,93(4):1327～1331)等。

阿维菌素(avermectin)是一种由阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的一类大环内酯类抗生素，具有广泛的驱虫和杀虫活性。阿维菌素链霉菌发酵液中通常含有8种阿维菌素组分A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a，B2b，其中，杀虫效果以B1组分最佳，尤其是B1a组分。阿维菌素的作用机制独特，与常规化学杀虫剂不同，杀虫效果是一般化学农药的几十倍，且不易使害虫产生抗性。阿维菌素的作用靶点是线虫及节肢动物类寄生虫的神经传导介质γ-氨基丁酸。它对哺乳动物的毒性很小、选择性很高，且在植物中的残留时间很短，土壤中的微生物能很快将其分解成无毒物质。由于阿维菌素的广谱、高效、无残留、对动植物高度安全等突出优点，已在农业、畜牧业、医药等领域广泛应用，具有广阔的市场前景和应用价值。

此外，以阿维菌素作为母体，还开发出了一系列活性更高、选择性更强、对动植物更安全的衍生产品，已经商业化的产品包括多拉菌素、伊维菌素、埃玛菌素等。

阿维菌素在国内已经实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。但是，阿维菌素的生产菌株还存在着发酵单位低，生产成本高等问题。如何提高阿维菌素的产量，降低生产成本，是阿维菌素研究中的一个重要课题。

发明内容

针对现有技术中的需求，本发明提供一种重组链霉菌，该重组链霉菌通过过表达乙酰乳酸合酶小亚基来促进乙酰乳酸合酶对该重组链霉菌中的L-异亮氨酸、L-缬氨酸和/或L-亮氨酸的生物合成，从而提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产物产量。本发明还提供一种提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产物(如阿维菌素、必特螺旋霉素、醌霉素等)产量的方法。

根据本发明的第一方面，提供一种重组链霉菌，其中所述重组链霉菌过表达序列表的氨基酸序列2所示的乙酰乳酸合酶小亚基ilvH。

根据一种实施方式，通过将编码所述乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因克隆到表达载体，再将得到的重组表达载体引入到出发链霉菌获得所述重组链霉菌。

所述出发链霉菌是以L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体产生抗生素的链霉菌。例如可以为野生型链霉菌，或经修饰、突变、诱变或基因重组获得的链霉菌。