[发明专利]ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及评价方法

权利要求书

1. 一种非疾病诊断目的免疫能力的评价方法，其特征在于，分离PBMC细胞， 测定基础ATP，包括如下步骤：

（1）用肝素抗凝管采集血液，分离前上下颠倒混匀8次，使细胞分布均匀；

（2）取一支15ml离心管，加入5ml无FBS的 RPMI1640，用巴氏吸管加入RPMI1640和血液体积比为1:1的血样，轻轻地上下颠倒混匀8次，达到颜色均一；

（3）另取一支新的15ml离心管，用电动移液枪加入5ml Ficoll分离液，使分离液与血样体积比为1:2，将离心管倾斜一定角度，用巴氏吸管小心将稀释的血样加到Ficoll上层，使分层清晰；

（4）将离心机条件设置为800g，20℃，acce，Brake均设为0，离心30min；

（5）离心后用巴氏吸管弃掉血浆至白色分层上约0.5-1cm处即可，切勿搅动白膜层；

（6）再用巴氏吸管小心转移白膜层至一支新的1.5ml离心管，吸出体积为1.5ml；

（7）将离心机条件设置为5000rpm， 20℃，离心10min，离心后倒净离心管中液体并置于灭菌的吸水纸上，只留附在壁上的细胞，加入无FBS的 RPMI至总体积为1.5ml，轻轻吹打重悬细胞；

（8）将离心机条件设置为3000rpm， 20℃，离心10min，离心后倒净离心管中液体并置于灭菌的吸水纸上，只留附在壁上的细胞，然后加入1.5ml无FBS的 RPMI，轻轻吹打重悬细胞；

（9）第三次将离心机条件设置为400g，20℃，离心10min，离心后倒净离心管中液体并置于吸水纸上，只留附在壁上的细胞，加入1ml无FBS的 RPMI培养基轻轻吹打重悬细胞；取10ul用于台盼蓝染色，计数并计算存活率；

（10）取按上述方法分离计数的PBMC细胞每孔30万个，加入到1.5ml离心管中，800g， 20℃，离心7min，离心后倒净离心管中液体后置于吸水纸上吸一下，加入200ul裂解液，在冰上充分裂解细胞5min，然后置于100度水浴锅中煮沸1min，立即置于冰上待测；其中，裂解液由20 mmol/L Tris和2 mmol/L EDTA组成，pH为7.75；

（11）在冰上进行标准品配制：冰上溶解10umol/L ATP标准品贮存液，把ATP标准溶液用ATP裂解液稀释成 0,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0 umol/L浓度梯度；ATP标准溶液浓度可根据样品中ATP的浓度而调节；

（12）在冰上加入10ul样品或标准品于96孔白色不透明酶标板中，置于酶标仪中选择LU，终点法，562nm检测其本底的荧光值；

（13）加100ulATP检测液到含样品或标准品的96孔白色不透明酶标板中，迅速用排枪混匀，立即用酶标仪选择LU，终点法，562nm测定；

（14）根据ATP含量进行分析：ATP的浓度＜150ng/ml或ATP的浓度≥500ng/ml为免疫能力异常；其中，ATP的浓度＜150ng/ml为免疫力低下；ATP的浓度≥500ng/ml为免疫力超常；150ng/ml≤ATP的浓度＜500ng/ml为免疫力正常。