[发明专利]重组人CC16基因、其真核表达载体的构建及重组蛋白的纯化

权利要求书

1.一种重组人CC16基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种含有权利要求1所述重组人CC16基因的真核表达重组质粒，是以Xho I和EcoR I双酶切的重组人CC16基因与真核表达载体pMSVpuro连接构成，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述真核表达重组质粒的真核细胞表达系统，是将所述真核表达重组质粒转入HEK 293T 细胞中构建。

4.一种在HEK 293T 细胞表达体系中生产重组人CC16蛋白的方法，包括以下步骤：

1) 根据人CC16蛋白质对应的核苷酸序列，合成权利要求1所述的重组人CC16基因；

2) 将重组人CC16基因连接到真核表达载体pMSVpuro中，构建含有所述重组人CC16基因的真核表达重组质粒pMSCVpuro-hCC16；

3) 以所述真核表达重组质粒pMSCVpuro-hCC16转染HEK 293T细胞，构建含有重组人CC16基因的HEK 293T 稳定细胞表达系统；

4) 在所述HEK 293T稳定细胞表达系统中，无血清培养基体系下培养表达重组人CC16蛋白；

5) 分离并纯化所述重组人CC16蛋白；

其中，所述步骤2)中的真核表达载体pMSCVpuro经Xho I和EcoR I双酶切后与同样双酶切的重组人CC16基因连接。

5.根据权利要求4所述的生产重组人CC16蛋白的方法，其中所述的HEK 293T 细胞在含有10%新生牛血清，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃和5%CO₂条件下生长，3～4天换液一次。

6.根据权利要求4所述的生产重组人CC16蛋白的方法，其中所述步骤3)中，在转染24小时后加入终浓度为1.5μg/ml的嘌呤霉素，细胞培养48小时，以筛选出稳定表达人CC16蛋白的细胞克隆。

7.根据权利要求4所述的生产重组人CC16蛋白的方法，其中步骤5)所述重组人CC16蛋白的分离并纯化过程为：

收集步骤4)无血清培养基上清；

剩余细胞用PBS洗涤，得到稳定转染pMSCVpuro-hCC16的细胞，以蛋白裂解液孵育30min，收集细胞裂解液；

将收集的细胞裂解液与无血清培养液离心，收集上清，4℃下加入预先用TBS平衡的ANTI-FLAG M₂亲和凝胶中，使蛋白与凝胶孵育过夜；

以TBS洗掉亲和凝胶上的未结合蛋白后，再用洗脱液洗脱亲和凝胶上结合的目的蛋白，洗脱液中加入0.5M Tris HCl，pH7.4；1.5M NaCl，使用截留分子量3kDa的浓缩管浓缩目的蛋白，得到纯化的重组人CC16蛋白；

其中，所述的蛋白裂解液含有50mM Tris-HCl，pH7.4；150mM NaCl；1mM EDTA；1%TRITON X-100；所述TBS含有50mM Tris HCl，150mM NaCl，pH7.4；所述洗脱液为0.1M甘氨酸-HCl，pH3.5。