[发明专利]重组人CC16基因、其真核表达载体的构建及重组蛋白的纯化

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种利用DNA重组技术合成的人CC16基因，及其真核表达重组质粒的构建和重组蛋白表达后的分离纯化。

背景技术

CC16蛋白质主要由细支气管、终末细支气管黏膜上的无纤毛柱状上皮细胞——Clara细胞分泌产生，因其分子量约为15.8kDa，故称为CC16蛋白，又称为Clara细胞分泌蛋白(Clara cell secretory protein，CCSP)。CC16为组织特异性蛋白，主要在肺组织表达，人的支气管肺泡灌洗液(BALF)中占可溶性蛋白的2%～3%。

研究表明，许多慢性肺部炎症性疾病的发生都与肺部Clara细胞减少及CC16含量降低有关，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等。COPD是以进行性发展的气流受限为特征的慢性呼吸道疾病，其发病机制尚未完全清楚，吸烟及细菌感染所致炎症反应是COPD发病的主要危险因素。吸烟者支气管上皮中Clara细胞数量明显减少，支气管肺泡灌洗液和血清中CC16含量也明显降低。Pilette C等研究发现，与健康人比较，COPD患者小气道中Clara细胞减少，导致CC16分泌减少，BALF中CC16含量减少。在香烟烟雾制备的大鼠COPD模型中也观察到了相同的结果，发现气道炎症出现时Clara细胞及CC16明显减少，而CC16减少又会引起气道抗炎能力下降，导致炎症进一步恶化。而在给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸后，通过促进Clara细胞的恢复及CC16的合成和分泌抑制气道炎症反应，可以减轻COPD的炎症。

作为内源性的抗炎物质，CC16在肺内有很重要的免疫调节和抗炎作用，其抗炎机制之一是抑制磷酯酶A₂(PLA₂)的活性。PLA₂是存在于几乎所有有核细胞的活性酶蛋白，分为依赖钙离子的分泌型的PLA₂(sPLA₂)和胞浆型PLA₂(cPLA₂)及非钙依赖型PLA₂(iPLA₂)。PLA₂是特异性的甘油磷脂Sn-2位脂键的水解酶类，是细胞内重要的信号分子。PLA₂是产生脂类介质及血小板活化因子(PAF)的限速酶，也是炎性细胞因子的活化对象。内毒素可以增加PLA₂的活性，进而加剧炎症反应。虽然作为内源性抗炎因子的CC16，其抗炎的具体分子机制尚不完全清楚，但体外研究证实，CC16可通过抑制PLA₂的活性，限制花生四烯酸代谢和以白三烯为介导因子的级联反应，从而抑制前列腺素和白细胞介质的合成。

因此，补充CC16以弥补慢性炎症性疾病过程中缺乏的抗炎因子，能否对疾病的发生发展起到干预作用，就非常值得关注。而采用基因过表达技术构建CC16的真核表达质粒，使之在肺上皮细胞中表达CC16蛋白，补充疾病过程中不足的CC16，是治疗COPD等肺部炎症性疾病的有效尝试。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人CC16基因，并构建其真核表达重组质粒，转染细胞后生产重组人CC16蛋白质并纯化，从而为利用该重组蛋白质对炎症性肺部疾病进行干预性治疗创造条件。

本发明根据人CC16蛋白质的cDNA全基因序列，设计合成了重组人CC16基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在基因的两端分别加入了Kazak序列和3×Flag标签。

本发明同时提供了一种含有上述重组人CC16基因的真核表达重组质粒，使用了真核表达载体pMSVpuro，其带有Xho I和EcoR I酶切位点，将经Xho I和EcoR I双酶切的重组人CC16基因与所述真核表达载体pMSVpuro连接，构成本发明的真核表达重组质粒，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种包含所述真核表达重组质粒的宿主细胞，将所述真核表达重组质粒转入HEK 293T细胞中，构建了含有所述真核表达重组质粒的真核细胞表达系统。

本发明还提供了在HEK 293T细胞表达体系中生产所述重组人CC16蛋白的方法，包括以下步骤：

1) 根据人CC16蛋白质对应的核苷酸序列，合成重组人CC16基因；