[发明专利]芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法

权利要求书

1.区分芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法，其特征在于：对芸薹属栽培种的线粒体和叶绿体DNA为模板，用以下13对特异引物对ccmp2、trnL-F、rpl16、trnE-trnT、ACP2、ACP4、ACP35、ACP38、ACP47、ACP29、PsbB-PsbT、BnTR1、BnTR4进行扩增，所述芸薹属栽培种包括白菜、甘蓝、黑芥、甘蓝型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥，其中：

第一对引物序列为：

正向引物5’-GATCCCGGACGTAATCCTG-3’

反向引物5’-ATCGTACCGAGGGTTCGAAT-3’

第二对引物序列为：

正向引物5’-TCAATTGCACATTCTAGAATTCTAAG-3’

反向引物5’-CAATTCAATATGGTTATATATTAGAG-3’

第三对引物序列为：

正向引物5’-GGTTCCGTCGTTCCCATCGC-3’

反向引物5’-CATAATAATTAGATAAATCTGTTCC-3’

第四对引物序列为：

正向引物5’-AATGGTATGACTAGCTTATAAGG-3’

反向引物5’-CTTAACAATGAGATGAGGCAATC-3’

第五对引物序列为：

正向引物5’-GAAAAATGCAAGCACGGTTT-3’

反向引物5’-TACGATCCGTAGTGGGTTGC-3’

第六对引物序列为：

正向引物5’-TACCCGTATTAGGCACTA-3’

反向引物5’-TTTGTAAGACCACGACTG-3’

第七对引物序列为：

正向引物5’-ATTGGCTTACTTCTTGCG-3’

反向引物5’-GGTTTCCGGGATGTTATT-3’

第八对引物序列为：

正向引物5’-GGTTCGTTAGCAGGTTTA-3’

反向引物5’-GTTCCCTAGCAACACTTT-3’

第九对引物序列为：

正向引物5’-TGTACTTATGGGAAAGCG-3’

反向引物5’-CTGGGTTCTTCTACTTCATT-3’

第十对引物序列为：

正向引物5’-GGCCATAGGCTGGAAAGTCT-3’

反向引物5’-GTTTATGCATGGCGAAAAGG-3’

第十一对引物序列为：

正向引物5’-CCAAAAACTTGGAGATCCAACTAC-3’

反向引物5’-TTCCATAGATTCGATCGTGGTTTA-3’

第十二对引物序列为：

正向引物5’-CCGTTAGGGGTATTTAGTAACTCG-3’

反向引物5’-ACATAATGGCAATGTATCGGACTG-3’

第十三对引物序列为：

正向引物5’-GAAGTCCGAGGACCTTTAGTACC-3’

反向引物5’-AGTAAGTTGTAGGTAGGGGCTTCAT-3’，

用其线粒体和叶绿体目标基因的特异性引物进行PCR扩增，将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，根据植物材料间的遗传距离聚类结果，区分来自不同栽培种的细胞质。

2.根据权利要求1所述的区分芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法，其特征在于：所述PCR的反应体系如下：

PCR反应体系为10μL，包含20ng模板，正向引物和反向引物各0.25μmol/L，1x Taqbuffer，MgCl₂1.5mmol/L，每种dNTP 0.2mmol/L，0.5U的Taq DNA聚合酶，然后用ddH₂O补足10ul；采用Touch down扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃；94℃变性1min，57℃退火30s，72℃延伸45s，28个循环；72℃延伸10min；通过PCR扩增，分别获得100-400bp的片段。

3.如权利要求1-2任一项所述的区分芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法在油菜杂交选育中的应用。