[发明专利]芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法

说明书

本发明公开了芸薹属几个栽培种细胞质的分子检测方法，用其线粒体和叶绿体目标基因的特异性引物进行PCR扩增，将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，根据植物材料间的遗传距离聚类结果，区分来自不同栽培种的细胞质；本发明能快速、有效地鉴别芸薹属栽培种细胞质，为品种选育和材料创新提供帮助。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法。

背景技术

芸薹属栽培种包括白菜(B. rapa；AA, 2n = 20)、甘蓝(B. oleracea；CC, 2n =18)和黑芥(B. nigra；BB, 2n = 16) 3个二倍体基本种以及甘蓝型油菜(B. napus；AACC,2n = 38)、芥菜型油菜(B. juncea；AABB, 2n = 36)和埃塞俄比亚芥(B. carinata；BBCC,2n = 34) 3个四倍体复合种。

远缘杂交是同种间属间甚至亲缘关系更远的物种之间的杂交，可以把不同种、属的特征、特性结合起来，从而突破种属界限，扩大遗传变异，从而创造新的变异类型或新物种。

甘蓝型油菜是芸薹属中的重要作物之一，在世界范围内均有较大的种植面积。甘蓝型油菜为异源双二倍体。由基本种白菜型油菜和甘蓝在自然界通过种间杂交后双二倍化进化而来。随着育种工作的不断深入，甘蓝型油菜种内可利用的基因资源日趋贫乏。可以有意识地利用属间甚至亲缘关系更远的物种进行杂交，能有效拓展甘蓝型油菜的遗传变异，充分利用远缘物种的高度抗病性和对环境胁迫的抵抗能力，来改良栽培品种。

植物细胞质有自己的遗传系统，它的DNA分布于线粒体和叶绿体中，细胞质DNA能通过自己的转录翻译系统来指导部分细胞质生物大分子的合成，如卡尔文循环中的关键酶——核酮糖羧化酶（加氧酶）的大亚基、线粒体中细胞色素氧化酶蛋白。植物细胞质具有高度异质性，由细胞质遗传系统决定，不受细胞核基因及环境因素的影响。

目前，针对芸薹属不同栽培种之间细胞质的鉴别方法研究较少，而针对甘蓝型油菜中几种常见的细胞质类型：Nap细胞质类型(Nap)、玻里玛系统细胞质(Pol)、陕2A细胞质(2A)、Cam细胞质类型、萝卜质细胞质类型 (Ogu)等的鉴别较多。通常采用普通遗传学方法、线粒体基因组DNA的限制性片段长度多态性（mtDNA-RFLP）（杨光圣等，中国农业科学，2009,31(1):27-31）、PCR技术（程计华等，作物学报，2008,34(11):1946-1952；张瑞杰等，西北农业学报, 2012,21(10):59-64）。普通遗传学鉴定费时费力，需要2～3年，mtDNA-RFLP方法实验周期缩短到几天时间，但线粒体DNA的限制性酶切和酶切片段的分离检测操作难度大且成本高，应用PCR技术检测是现今最为简洁方便的方法。

目前，芸薹属栽培种的线粒体和叶绿体全基因组已被测序，可以根据这些特异基因组序列开发分子标记，利用PCR技术快速鉴别不同栽培种的细胞质类型，由此将极大地提高工作效率。

发明内容

本发明的目的是解决目前缺乏芸薹属栽培种细胞质分子鉴定方法的问题，提供芸薹属几个栽培种细胞质的分子检测方法。

本发明采用的是PCR技术，是针对芸薹属栽培种细胞质目标基因特定位点设计特异引物，进行PCR扩增，检测得到的DNA多态性，以此做为分子标记的技术。