[发明专利]一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域。

背景技术

β-葡聚糖其来源于新鲜的食品啤酒酵母、燕麦、食用菌类等。根据糖键结构差异可分β-（1→3）-葡聚糖和β-（1→6）-葡聚糖，β-葡聚糖的活性结构是有葡萄糖单位组成的多聚糖，她能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，从而提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体的含量，全面刺激机体的免疫系统。此外，β-葡聚糖还有清楚游离基、抗辐射、溶解胆固醇，预防高脂血症及抵抗滤过性病毒、真菌、细菌等感染等作用，固广泛用于医药、食品、化妆品等行业。β-葡聚糖还具有治疗肿瘤、肝炎、心血管、糖尿病和降血脂、抗衰老等方面有独特的生物活性。因此检测β-葡聚糖在食品领域和化妆品领域都有很广阔的空间。

真菌的细胞壁主要成分为(1,3)-β-D葡聚糖（βG）。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理，βG可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中β-葡聚糖含量增高。对βG进行测定，实现真菌感染早期诊断及早期治疗，是改善患者愈后，提高患者生存质量的关键。

国内外用于检测β-葡聚糖的方法如下：

1.粘度法:原理是大麦抽提液粘度主要由β-葡聚糖产生,但β-葡聚糖粘度同时与含量和分子量有关,分子量越大,粘度越大,因此该法测定结果误差很大。

2.沉淀法:原理是利用特定盐或有机溶剂沉淀抽提液中价葡聚糖;该方法局限性在于抽提不能完全排除其它物质干扰。

3.酶法:此方法采用特定β-葡聚糖内切酶得到寡糖,经酸解后采用葡萄糖氧化酶/过氧化酶试剂测定葡萄糖含量,双酶法有较高的专一性和准确性,是目前国际上较通用的测定方法,缺点是测定时间长, 试剂盒单价高, 试剂保存时间短。

4.刚果红:用于测定啤酒中βG含量,能和多种聚合糖发生作用，形成颜色浓郁的多聚糖-刚果红络合物。但测定的结果过低, 可能是供试品中βG分子被其他分子包裹未能充分溶解, 使显色不足, 故不适于测定固态供试品中βG含量。

5.荧光法:主要是利用荧光物质可与β-葡聚糖特异性结合，而与其它多糖和纤维素、戊聚糖亲和力很弱这一特性进行测定，此法在一些啤酒企业中使用。

6.苯酚-硫酸法：测定结果与供试品的已知含量有相当大的差别, 可能因为多糖和寡糖被浓硫酸水解成单糖, 并通过苯酚显色, 对βG无专一性。

7.鲎试剂法:测定微量β-葡聚糖的方法就是利用鲎试剂（鲎的血细胞提取物），原理：G因子是丝氨酸蛋白酶前体，通过结合βG而被活化，从而启动G因子系统的蛋白酶级联。并且被活化的G因子使凝固酶前体被活化，最终生成凝胶。将含鲎血细胞提取物的试剂与含βG的血液样品混合，测定该混合液在光照射开始之后达到规定值所需的时间，将所得的该时间代入使用浓度已知的βG溶液预先制成的表示凝胶化时间与βG浓度的关系的标准曲线中，求出样品中的βG浓度，对患者做出真菌感染的检测。虽然这种检测方法灵敏度很高，但是鲎血源于天然材料，必将会担心资源的枯竭，鲎现已经列入某些地区的二级保护动物，因此鲎试剂的成本比较高，还需要对样品进行前处理，测定时间长。

因此，现今国内外对βG浓度的测定方法都不是很理想，有些方法存在稳定性差、特异性差、价格昂贵、灵敏性差、检测时间长等缺点，本专利发明了对βG的新型测定方法，为将来的食品检测、医药开发、化妆品检测和疾病检测等领域提供技术基础，满足现代生物检测各领域日益增长的需求。

发明内容

本发明的目的是：提供一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，它能够低成本高敏度特异性地测定βG。

本发明的方法是：利用基因重组的方法，克隆了来自鲎血中基因的大小为1251bp的特定氨基酸序列,将此序列连接到PET-15b的表达质粒上，转到BL21的表达菌中大量表达，纯化了对βG具有特异结合性的蛋白质。

表达蛋白可以与β-葡聚糖特异性结合，形成一定结构的复合物，在促聚剂聚乙二醇作用下，成为悬浮于反应溶剂中的微粒，使样品浊度发生变化；当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于复合物的吸收其吸光值增大，故在一定范围内吸收度与复合物量呈正相关；当蛋白质浓度固定时，样品的浊度与其中所含βG量成正比，绘制标准曲线，从而达到未知βG的测定。

采用粒径为180nm的大颗粒聚乙二醇微乳颗粒，具有较大的粒径，增加血液中βG和蛋白反应时的浊度，从而增加测试反应的灵敏度、缩短了反应时间，可以在570nm的波长下进行检测；用固定的蛋白质浓度测定不同βG量，测出吸光值，绘制曲线，得到一定范围内的标准曲线，可以求出未知βG的量。

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